（1.广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088；2.广东省亚热带果蔬加工科技创新中心，广东湛江524088）
摘要：为进一步丰富复合果醋的种类，提升果醋的香气，以菠萝和菠萝蜜为原料进行多菌种混合发酵，以果醋总酸和感官评分为指标，采用单因素和正交试验优化发酵工艺条件，以顶空固相微萃取（headspacesolid-phasemicroextraction，HS-SPME）结合气相色谱-质谱联用（gaschromatography-massspectrometry，GC-MS）技术分析菠萝和菠萝蜜复合果醋的挥发性物质。结果表明，最优工艺条件为菠萝与菠萝蜜体积比6∶4，醋酸发酵阶段，初始pH4.5、乙醇体积分数6%、醋酸菌接种量11%、发酵温度28℃，在该条件下发酵8d，复合果醋的总酸（以乙酸计）为31.92g/L。进一步检测其挥发性物质，共分析出乙酸、3-羟基丁酸乙酯、乙酸异戊酯、异戊醇、苯乙醇和苯甲醛等54种主要挥发性物质。该文对菠萝和菠萝蜜复合果醋发酵工艺及挥发性物质进行研究，为复合果醋的开发提供参考。
关键词：菠萝；菠萝蜜；复合果醋；发酵工艺优化；顶空固相微萃取；气相色谱-质谱联用
果醋是以水果为原料，以酵母菌和醋酸菌发酵为主，通过乙醇和醋酸发酵而得，同时具有水果风味和食醋营养特性，如抗氧化、抗疲劳、调节机体代谢、调节脂质代谢以及调节免疫等功能[5]。市售果醋大多为单一果醋，风味单一，而复合果醋可以同时兼具两种以上水果的独特风味，改善口感，张海玲等[6]以梨和山药为原料，制得同时具有梨香和山药香的复合果醋；王晓丽等[7]制备出了典型酥梨和柚子风味的复合果醋。
研究表明，酿酒酵母可以利用乳酸菌发酵所得的乳酸为底物进行乳酸乙酯、丁酸乙酯等其他香气化合物的合成[8]，同时，乳酸菌通过影响酵母菌的代谢，进而调节香气物质的产生[9]。Tristezza等[10]接种酵母菌和乳酸菌共同发酵葡萄酒，发现葡萄酒的挥发性酸有所降低，酯类物质含量有所增加。Chen等[11]的研究表明，在柑橘果醋乙醇发酵过程中加入植物乳杆菌，可明显提高果醋中浓香型乳酸乙酯的含量。田璐等[12]通过酿酒酵母、植物乳杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌混合发酵，使果醋的挥发性风味物质种类增多。贾瑞娟等[13]的研究表明，在芽孢杆菌与醋酸菌、乳酸菌共同培养下，山西老陈醋的乙酸乙酯、异戊酸乙酯等特征香气物质含量有所提高。因此，在果醋发酵过程中，加入植物乳杆菌可以有效增加酯类含量，减弱醋酸的刺激口感，进而改善果醋风味。
目前，复合原料和多种菌株同时发酵的研究报道较少，因此，将产量高的菠萝与菠萝蜜浓郁的香气相结合，开发一种新型复合果醋具有重要意义。本研究以菠萝和菠萝蜜为发酵原料，采用酵母菌、植物乳杆菌和醋酸菌进行多菌种发酵，优化醋酸发酵工艺，分析挥发性物质，以期为菠萝和菠萝蜜复合果醋的开发提供参考。
1.1.1材料
菠萝、菠萝蜜：市售；酿酒酵母：安琪酵母股份有限公司；植物乳杆菌（ACCC11095）：广东省微生物菌种保藏中心；Aa941醋酸菌：广东海洋大学微生物实验室筛选。
1.1.2主要试剂
焦亚硫酸钠、柠檬酸、L-抗坏血酸、无水葡萄糖（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；果胶酶（>1000U/g）：山东隆科特酶制剂有限公司；YPD肉汤培养基：生工生物工程（上海）股份有限公司；MRS肉汤培养基、酵母浸粉、琼脂粉：北京陆桥技术股份有限公司；2-辛醇标准品（纯度98%）：北京索莱宝科技有限公司。
GC-MS-TQ8050NX气相色谱-质谱联用仪：日本岛津公司；50/30μmPDMS/DVBSPME萃取头：美国Supelco公司；WYT-1手持式折光仪：杭州汇尔仪器设备有限公司；HH-6电热恒温水浴锅：国华电器有限公司；HZQ-F160振荡培养箱：北京东联哈尔仪器制造有限公司；LTI-700W生化培养箱：埃朗科技国际贸易（上海）有限公司；PHS-3EpH计：上海仪电科学仪器股份有限公司。
1.3.1种子液的培养
酵母菌活化液：接种0.02%活性干酵母于葡萄糖培养基中30℃振荡培养30min。
酵母菌种子液：吸取10mL酵母菌活化液至90mLYPD培养基中，于28℃培养24h。
植物乳杆菌种子液：从斜面挑取1～2环植物乳杆菌于100mLMRS培养基中，37℃培养48h。
醋酸菌活化液：从斜面挑取1～2环醋酸菌于20mL醋酸菌培养基（1%葡萄糖、1%酵母浸粉，自然pH值）中进行活化，30℃培养48h。
醋酸菌种子液：从醋酸菌活化液中吸取1mL至100mL醋酸菌培养基中进行扩培，30℃培养48h，备用。
1.3.2工艺流程
菠萝和菠萝蜜复合果醋发酵工艺流程见图1。
图1菠萝和菠萝蜜复合果醋发酵工艺流程Fig.1Fermentationprocessofcompoundfruitvinegarofpineappleandjackfruit
操作要点如下。
护色：置于0.8%柠檬酸与0.01%抗坏血酸质量比为1∶1的护色液中浸泡20min[14-15]。
打浆：护色后按体积比1∶1.5加入蒸馏水进行榨汁。
酶解：加入0.5g/L的果胶酶，搅拌均匀后30℃静置，酶解3h。
调糖度：添加白砂糖调节糖度至20%。
乙醇发酵：同时接种3%植物乳杆菌（1×107CFU/mL）和3%酿酒酵母（1×106CFU/mL）发酵6d[16]。
调节pH值：使用pH计，利用柠檬酸和碳酸氢钠饱和溶液，调节pH值。
1.3.3果汁混合体积比的确定
将打浆后未调糖度的菠萝和菠萝蜜果汁以不同体积比（1∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5）混合，进行感官评分。
1.3.4醋酸发酵单因素试验
1.3.4.1乙醇体积分数对总酸含量的影响
分别调节乙醇体积分数为2%、4%、6%、8%、10%，初始pH3.5，接种8%醋酸菌种子液，置于31℃振荡培养7d，测定总酸含量。
1.3.4.2初始pH值对总酸含量的影响
调节乙醇体积分数为6%，初始pH值分别为2.5、3.5、4.5、5.5、6.5，接种8%醋酸菌种子液，置于31℃振荡培养7d，测定总酸含量。
1.3.4.3醋酸菌接种量对总酸含量的影响
调节乙醇体积分数为6%、初始pH3.5，分别接种5%、8%、11%、14%、17%醋酸菌种子液，置于31℃振荡培养7d，测定总酸含量。
1.3.4.4发酵温度对总酸含量的影响
调节乙醇体积分数至6%、pH3.5，接种8%醋酸菌种子液，分别置于25、28、31、34℃振荡培养7d，测定总酸含量。
1.3.5醋酸发酵正交试验
在单因素试验的基础上，以总酸含量为指标，设计四因素三水平正交试验，因素及水平见表1。
表1正交试验因素水平Table1Factorsandlevelsoforthogonaltest
因素水平C乙醇体积分数/%123A醋酸菌接种量/%111417B初始pH值3.54.55.5246D发酵温度/℃252831
1.3.6挥发性物质检测
采用顶空固相微萃取（headspacesolid-phasemicroextraction，HS-SPME）结合气相色谱-质谱联用（gaschromatography-massspectrometry，GC-MS）技术分别对最优工艺获得的菠萝和菠萝蜜复合果醋（1号醋）；不同原料、相同菌种、相同工艺条件发酵的单菠萝醋（2号醋）以及相同原料、相同工艺条件、不添加植物乳杆菌发酵的菠萝和菠萝蜜复合果醋（3号醋）进行挥发性物质分析，参考Al-Dalali等[17]的方法并略作改动，为更好地分离挥发性物质，本研究以2-辛醇为内标物。
HS-SPME条件为加入8mL样品和1.9g氯化钠于20mL顶空瓶中，加入5μL的2-辛醇（0.822mg/mL，稀释于甲醇）作为内标物，加入磁力搅拌子，用内衬聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）硅胶垫的瓶盖密封，置于45℃恒温磁力搅拌水浴锅中，使用50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取头插入顶空瓶中，于液面上方进行顶空萃取30min，于250℃下解吸5min。每种样品做3组平行试验。
GC-MS条件为HP-INNOWAX毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；载气：高纯度氦气，载气流速1mL/min，分流进样；程序升温：40℃保持3.5min，以5℃/min的速率升温至90℃并保持2min，然后以12℃/min的速率升温至230℃并保持10min。电离方式：电子轰击（electronimpact，EI）；电离电压：70eV；离子源温度：250℃，传输线温度：250℃；质量扫描范围：m/z33～450。
定性方法：采用NIST14s.lib谱库对挥发性物质进行定性分析。
定量方法：根据罗美燕等[18]的方法，采用内标法进行半定量，即挥发性成分通过各挥发性物质峰面积（A）与已知浓度的内标物（2-辛醇）峰面积（A0）的比值进行定量，每种样品做3组平行试验，结果以平均值±标准差表示。挥发性成分质量浓度的计算公式如下。
式中：X为挥发性成分质量浓度，μg/L；A为挥发性物质的峰面积；A0为内标物（2-辛醇）的峰面积；0.822为内标物浓度，mg/mL；5为内标物体积，μL；V为样品体积，mL。
1.3.7主要指标测定方法
利用手持折光仪进行糖度测定；总酸（以乙酸计）测定参照GB12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》中的酸碱滴定法；乙醇体积分数的测定参照GB5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》中的旋蒸法。
感官评价：由11人组成评判小组，根据NY82.2—1988《果汁测定方法感官检验》进行感官评分。
所有试验重复3次，数据结果以平均值±标准差的形式表示，使用JMPPro16软件进行显著性分析，使用Origin2021b和Excel软件绘制图表。
以果汁的颜色、风味、滋味和组织形态为评价要素，对6组不同果汁体积比的复合果汁进行感官评价，结果如图2所示。
图2不同菠萝与菠萝蜜体积比混合果汁的感官评分Fig.2Sensoryscoresofmixedjuiceswithdifferentvolumeratiosofpineappleandjackfruit
不同字母表示差异显著（P<0.05）。
由图2可知，菠萝与菠萝蜜体积比为1∶0、9∶1、8∶2、7∶3、5∶5时的感官评分无显著性差异（P>0.05），菠萝与菠萝蜜体积比为6∶4时感官评分最高。
2.2.1乙醇体积分数对复合果醋总酸含量的影响
乙醇体积分数对复合果醋总酸含量的影响如图3所示。
图3乙醇体积分数对复合果醋总酸含量的影响Fig.3Effectofalcoholconcentrationontotalacidofcompoundfruitvinegar
由图3可知，乙醇体积分数为2%和8%时，没有显著差异（P>0.05）；4%、6%、10%时差异显著（P<0.05）。乙醇体积分数为2%～4%时，总酸含量增加；4%时达到最高；在4%～10%之间，总酸含量持续下降。乙醇是乙酸发酵的基质，乙醇体积分数过低时，醋酸菌的代谢产物较少；过高的乙醇会影响醋酸菌的生长。
2.2.2初始pH值对复合果醋总酸含量的影响
初始pH值对复合果醋总酸含量的影响见图4。
图4不同pH值对复合果醋总酸含量的影响Fig.4EffectofpHvalueontotalacidofcompoundfruitvinegar
由图4可知，随着初始pH值的升高，总酸含量呈先升高后降低的趋势。醋酸菌在初始pH3.5～6.5之间，适宜生长。在初始pH2.5时，几乎不生长。初始pH2.5～4.5时，总酸含量升高；当初始pH4.5时，总酸含量达到最高；初始pH4.5～5.5时，总酸含量降低。初始pH值过低或过高均会影响醋酸菌中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性[19]，代谢受限，总酸含量也会降低。
2.2.3醋酸菌接种量对复合果醋总酸含量的影响
醋酸菌接种量对复合果醋总酸含量的影响见图5。
图5醋酸菌接种量对复合果醋总酸的影响Fig.5Effectofinoculumofaceticacidbacteriaontotalacidofcompoundfruitvinegar
由图5可知，不同醋酸菌接种量的复合果醋总酸含量呈先升高后降低的趋势，且差异显著（P<0.05）。醋酸菌接种量为5%～14%时，总酸含量持续升高；14%时达到最高；醋酸菌接种量为14%～17%时，总酸含量降低。醋酸菌接种量过小，菌种生长缓慢，发酵周期延长；接种量过多时，发酵前期醋酸菌快速生长，发酵液中营养物质消耗快，菌种代谢物加速醋酸菌老化，总酸含量不再呈增加趋势。
2.2.4发酵温度对复合果醋总酸含量的影响
发酵温度对复合果醋总酸含量的影响见图6。
图6发酵温度对复合果醋总酸的影响Fig.6Effectoffermentationtemperatureontotalacidofcompoundfruitvinegar
由图6可知，发酵温度为25～28℃，总酸含量增加；28～31℃总酸含量差异不显著（P>0.05），在该范围内适合醋酸菌生长；31～34℃时总酸含量降低。发酵温度过低，醋酸菌生长缓慢，代谢产物少，延长发酵周期；发酵温度过高会影响醋酸菌体内酶、蛋白质等活性，醋酸菌代谢受限，总酸含量也会降低。
因此，分别选择乙醇体积分数2%、4%、6%；初始pH3.5、4.5、5.5；醋酸菌接种量11%、14%、17%；发酵温度25、28、31℃作为正交试验设计水平。
醋酸发酵正交试验结果见表2。
表2正交试验设计与结果Table2Orthogonalexperimentdesignandresult
试验号C乙醇体积分数/%123456A醋酸菌接种量/%111111141414B初始pH值3.54.55.53.54.55.5246462D发酵温度/℃252831312528Y总酸含量（以乙酸计）/（g/L）14.5926.8328.7620.7228.8114.05
续表2正交试验设计与结果Continuetable2Orthogonalexperimentdesignandresult
试验号C乙醇体积分数/%789K1624Y总酸含量（以乙酸计）/（g/L）26.5815.0727.63K2K3k1k2k3极差R主次顺序最优组合A醋酸菌接种量/%17171770.1863.5869.2823.3921.1923.092.2B初始pH值3.54.55.561.8970.7170.4420.6323.5723.482.8543.7175.1884.1514.5725.0628.0513.48D发酵温度/℃28312571.0367.4664.5523.6822.4921.522.16C>B>A>DA1B2C3D1
从表2的极差分析可以看出，4个因素对复合果醋总酸含量的影响程度依次是C>B>A>D，即乙醇体积分数>初始pH值>醋酸菌接种量>发酵温度。比较极差得出各因素的最优水平，最佳组合为A1B2C3D1，即菠萝和菠萝蜜复合果醋醋酸发酵最佳工艺条件为醋酸菌接种量11%、初始pH4.5、乙醇体积分数6%、发酵温度28℃。在此条件下发酵8d，总酸含量为（31.92±0.12）g/L。
通过最优工艺获得的菠萝和菠萝蜜复合果醋（1号醋）；不同原料、相同菌种、相同工艺条件发酵的单菠萝醋（2号醋）以及相同原料、相同工艺条件、不添加植物乳杆菌发酵的菠萝和菠萝蜜复合果醋（3号醋），将3种果醋的挥发性物质与NIST14s.lib谱库进行比较，相似度高于85%予以保留，鉴定出的挥发性物质种类的数量和质量浓度结果如图7、图8所示。
图73种果醋不同种类挥发性物质的数量Fig.7Quantitativeofvolatiletypeofthreedifferentfruitvinegars
图83种果醋不同种类挥发性物质的总质量浓度Fig.8Massconcentrationsofvolatiletypeofthreedifferentfruitvinegars
由图7、图8可知，1号、2号和3号醋分别鉴定出54、55种和47种挥发性化合物，3种果醋的酯类、酸类和醇类均高于其他类别化合物，是重要的挥发性物质。从种类的数量来看，1号醋的酯类、萜类比其他两种果醋多，其中，酯类化合物的质量浓度最高，为131378.41μg/L，比2号醋高出36%，比3号醋高出63%；酚类化合物的数量与2号醋相同；酸类、醇类、醛类、酮类和其他类型化合物的数量与3号醋相同。从总质量浓度来看，1号醋的酯类、醛类化合物远高于其他两种果醋，酸类、酮类、酚类和烷烃类化合物均低于其他两种果醋。
3种果醋挥发性成分鉴定结果见表3。
表33种果醋挥发性成分鉴定结果Table3Identifyingresultsofvolatilecompoundsofthreekindsoffruitvinegars
续表33种果醋挥发性成分鉴定结果Continuetable3Identifyingresultsofvolatilecompoundsofthreekindsoffruitvinegars
注：ND表示未检出；相对标准偏差为0～20%。
由表3可知，多种挥发性物质构成菠萝和菠萝蜜复合果醋的独特风味，含量越高的挥发性物质对风味的影响越大。1号醋中酯类物质含量较多的是3-羟基丁酸乙酯、乙酸异戊酯；酸类物质含量最多的是乙酸，但较2号、3号醋少；醇类物质含量较多的是异戊醇、苯乙醇和异丁醇；此外，苯甲醛、2，4-二叔丁基酚、芳樟醇、环辛四烯等物质的含量也较多。
酸类化合物是果醋中重要的化合物，所有酸类均被认为会影响果醋风味[26]，是酯类物质形成的前体物质之一。含量最高的是乙酸，乙酸具有强烈刺激酸味，余味短，且1号醋的乙酸含量比2号、3号醋少；辛酸、己酸和癸酸也是主要的挥发性酸，辛酸属于中链脂肪酸，有水果香气，可作为食用香料。3-甲基戊酸属于属于食用香料之一，具有青香，1号醋中的3-甲基戊酸高于2号醋，而在3号醋未检出。
醛类、酮类化合物较少，适量醛类化合物可以提高果醋的香气，3种果醋中的苯甲醛含量均最高，且1号醋高于2号、3号醋，该物质具有宜人的坚果香[22]。1号醋的其他醛类、酮类物质的含量比2号、3号醋少。
果醋中还检测出酚类化合物、芳烃类、萜类和烷烃类等其他含量较少的挥发性化合物，甘菊环具有芳香风味，而萜品则带来苦味，ɑ-松油醇、香茅醇、橙花叔醇和芳樟醇等萜类化合物具有酸香、果香[29]，虽然这些挥发性物质含量较少，但是与其他风味物质协同，对总体香气具有辅助作用，为果醋带来更丰富的香气。
为进一步丰富复合果醋的种类，提升果醋的香气，对混合原料和混合菌种2个方面进行研究。以菠萝和菠萝蜜为原料，以植物乳杆菌、酿酒酵母、醋酸菌为发酵菌种，采用单因素和正交试验对复合果醋进行发酵工艺优化，利用HS-SPME-GC-MS测定分析菠萝和菠萝蜜复合果醋的挥发性物质。结果表明，最优工艺条件为菠萝与菠萝蜜体积比6∶4，在醋酸发酵阶段，初始pH4.5、乙醇体积分数6%、醋酸菌接种量11%、发酵温度28℃，发酵8d后的总酸含量（以乙酸计）达到31.92g/L。进一步对挥发性物质进行分析，菠萝和菠萝蜜复合果醋中共检测出54种挥发性物质，主要挥发性物质有乙酸、3-羟基丁酸乙酯、乙酸异戊酯、异戊醇、苯乙醇和苯甲醛等。与单菠萝醋、不添加植物乳杆菌的菠萝和菠萝蜜复合果醋进行比较，添加植物乳杆菌的菠萝和菠萝蜜复合果醋含有更多的醛类和酯类，并且挥发性酸类有所降低。对菠萝和菠萝蜜复合果醋的发酵工艺和挥发性物质进行研究，为复合果醋的开发提供参考依据。
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FermentationTechnologyandVolatileSubstancesofCompoundVinegarofPineappleandJackfruit
YANShaobo1，HUANGHe1，2*，CHENJu1（1.CollegeofFoodScienceandTechnology，GuangdongOceanUniversity，Zhanjiang524088，Guangdong，China；2.GuangdongProvincialScienceandTechnologyInnovationCenterforSubtropicalFruitandVegetableProcessing，Zhanjiang524088，Guangdong，China）
Keywords：pineapple；jackfruit；compoundvinegar；optimizationoffermentationprocess；headspacesolidphasemicroextraction（HS-SPME）；gaschromatography-massspectrometry（GC-MS）
DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2024.11.018
基金项目：广东省科技计划项目（2015A020209165）
作者简介：颜韶波（1997—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品加工与安全。
*通信作者：黄和（1962—），男（汉），教授。
引文格式：颜韶波，黄和，陈菊.菠萝和菠萝蜜复合果醋发酵工艺及挥发性物质分析[J].食品研究与开发，2024，45（11）：143-151.
YANShaobo，HUANGHe，CHENJu.FermentationTechnologyandVolatileSubstancesofCompoundVinegarofPineappleandJackfruit[J].FoodResearchandDevelopment，2024，45（11）：143-151.