微讲堂兽医实验室的设计运行和污染风险管理方向微生物核酸

分子生物学实验室主要开展荧光定量PCR/RTPCR和普通PCR/RTPCR,祛除核酸分子的有效方法包括:一是送排风机组,持续向室内送入新风,形成正压,排出室内空气,形成负压;二是通过物理学方法,安装臭氧发生器,不断向实验室内供应臭氧,臭氧分子可破坏DNA,可灭活病毒、灭活细菌、灭活霉菌;三是通过化学方法,提倡用84消毒液来降解DNA,灭活细菌、病毒、霉菌等。实验室建设硬件设施越完善,越有利于运行管理;硬件建设不足,软件和管理要求就越高。基本原则是各区独立、注意风向、因地制宜、方便工作。

1.样品的接受和预处理

分子生物学检测实验室依据的检测样品类型不同,主要是病原微生物,如非洲猪瘟病毒,对人是无害的,只需要考虑样品预处理时能够满足基本要求即可,若病原微生物是新型冠状病毒则需重新考虑。接收到样品后,需要对外包装进行消毒等预处理过程,同时对样品进行编号置盲和备份保存;最后主要依靠高压灭菌来保证实验室的生物安全。

2.实验室分区设计平面图

双走廊四/三区:双走廊即洁净走廊和物料通道(普通走廊、污染走廊);四/三区主要指中间的功能区,做荧光定量PCR只需三区足以(体系配制、核酸提取、反应间),若是普通PCR/RTPCR,必须有PCR产物分析区(建议独立在三区之外)。

分区压力梯度设计及气流方向:人为控制压力梯度形成压力差,控制风向。一更中通过送风形成正压(+20P),风向两边吹,手消毒间和洁净走廊压力相同(+10P),洁物间压力高(+20P),体系配制间压力最高(+20P),反应体系坚决不可被污染,风吹向四周。反应间污染风险最高,应设置压力最低(-20P),风向中间吹形成压力陷阱。核酸提取间相对反应间压力较高(-10P)。

实验室分区物流方向:物料等进入洗消间,进行脱外包、清洗、消毒、高压后通过传物窗到达洁物间等;大多商品化试剂盒脱外包装后,将引物探针反应液等通过传物窗进入体系配制间,分装每个反应管后进入反应间;样品在预处理阶段处理成需要的体积通过传物间送达核酸提取间。用完的物品通过传递窗传至物料通道再到洗消间,形成单向性物流方向,避免二次交叉污染的发生。

实验室分区人流方向(进入-退出):进入体系配制间时需要淋浴,进入反应间和核酸提取间不需要淋浴,有淋浴设置可以很大程度上降低污染的交叉,若没有淋浴室只能通过更换衣服进出。

二、实验室建设

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实验室的选址:相对地势较高、僻静,无外源污染源;了解当地四季温差、季节性风向、温度变化范围、空气相对湿度、空气洁净度等;交通相对便捷、实验室外围地面应有防沙尘装备(铺石子、绿化)、路面应硬化;设施的保障要有给水有排水有电,保证医疗废弃物和废水的处理。

实验室的进排风口设置:进风口和排风口不建议设置在同一面墙上,最理想的是一侧进风,一侧排风,横向长度尽可能长,排风口与进风口至少有2米的高度差。

实验室的送排风量计算:形成压差才能形成可控的风向,实验室面积满足需求尽可能小,层高一般为2.2~2.3m;换气次数一般10~15次/h,在设计时应预留更大的换风能力;环境温度与湿度要适宜,一般湿度在40%~60%。

实验室的送风机箱:建议安装变频电机,输出功率可人为调整。安装粗效,过滤柳絮、杨絮等杂物,并定期清洗;中效主要过滤颗粒较大的灰尘(大于5微米)。南方地区夏季温度高建议安装冷盘降温,北方地区冬季温度低,建议安装暖盘。对于常年湿度较高的地区建议安装除湿装置。建议安装臭氧发生器,可定时开关。

机箱的安装及送风:进风机箱安装在技术夹层上面,使机箱与功能间管道距离最短,大大节省能耗。技术一次性投入越高,后期运行的费用越低。全进全排,不回风。

实验室必要的辅助设施:设备检修门、不锈钢操作台、防返地漏、紧急逃生门监控通讯系统、鞋柜更衣袋、缓冲间互锁、强制淋浴、手消毒器、压差计、闭门器。

三、实验室运行

硬件设施需维护保养,校准个别计量器具,实验室需定期验证;软件应具有操作规程(程序性文件)、实验记录、运行记录等;有些物料是重复使用的,需根据区域选择不同的颜色,工作鞋分区颜色、工作服分区颜色、洗衣机分区适用、移液器等喷涂颜色、风管分区颜色等;管理人员、工作人员、维护人员都要有相应职责,定期培训、定期考核。

四、污染风险管理

分子生物学实验室的污染源

外源污染:送风系统、物料外包装、工作鞋、工作服

样品交叉:样品采集、样品预处理、样品核酸提取、加样操作

PCR产物:单管意外开盖、热盖未冷却、垃圾未及时处理、高压PCR产物

阳性对照:浓度过高、开盖不当、加样不规范、处理不当、非对照使用

五、防污染长效机制

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技术人员队伍相对稳定、掌握必要的理论基础、实验室工作经验积累、持续的培训提高;必须要有风险意识、管理以风险为导向、预防为主,防范大于治理;建立验证制度、制定验证方案、按周月季进行不同范围验证;必须要有规范、以质量手册和程序文件规范实验室、污染-分析-解决-修改,螺旋式提升实验室质量体系。

实验室防污染的重要措施:一是防污染的硬件设施的通风控制,通过送排风对实验室进行自净,可减少50%的污染;二是风险管理,增强风险意识与风险控制,防大于治;三是人物流控制,认识最大的污染动力,控制实验器具耗材的交叉,人流和物流规范有序的流动。

THE END
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