本实验通过收集不同厂家酒曲发酵百药煎，筛选发酵百药煎最佳酒曲，对优选的百药煎发酵酒曲进行菌种分离及鉴定，以五倍子发酵后百药煎中含量升高的5个成分[10]：没食子酸、没食子酸甲酯、()-表没食子儿茶素、2,4,6-三-O-没食子酰-α-D-葡萄糖（2,4,6-tria-O-galloyl-α-D-glucose，TGαG）、2,4,6-三-O-没食子酰-β-D-葡萄糖（2,4,6-tria-O-galloyl-β-D-glucose，TGβG）作为考察指标，结合外观性状，对所分离的单一菌种进行纯种发酵百药煎工艺优化，为纯种发酵百药煎质量标准研究提供研究基础，同时为中药发酵饮片纯菌种发酵工艺研究提供参考。
1仪器与材料
1.1仪器
Waters717型高效液相色谱仪，美国Waters公司；ZHPL-200型立式恒温振荡培养箱、MJL-250型霉菌培养箱、HWS-250型恒温恒湿培养箱，天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；BT25S型十万分之一电子分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；KQ-500DV型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；LDZX-75KBS型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；SW-CJ-1F型单人双面净化工作台，上海苏净实业有限公司。
1.2药物与试剂
2方法与结果
2.1最佳发酵酒曲筛选
采用收集的不同酒曲发酵百药煎，以百药煎外观性状结合没食子酸含量，筛选出最佳发酵酒曲。
2.1.1酒曲发酵百药煎样品制备[23]称取五倍子细粉200g，绿茶叶20g各5份，“1.2”项下5种酒曲各60g；茶叶加20倍量蒸馏水煎煮15min，滤过，五倍子粉末与相应的酒曲混匀后，加茶渣与适量茶汁制“握之成团，掷之即散”的软材，置于温度30℃、湿度85%恒温恒湿箱中发酵至表面遍布白霉，取出，60℃烘干，编号依次为Y1～Y5。
2.1.2没食子酸含量测定参考文献中没食子酸含量测定方法[13]，取Y1～Y5号百药煎样品，测定百药煎样品中没食子酸含量。根据不同酒曲发酵百药煎中没食子酸含量并结合外观性状，筛选出最佳发酵酒曲为根霉曲。结果见表1。
2.2发酵优势菌种筛选
2.2.1马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）配制称取37.0g，加入1000mL蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装至锥形瓶中，121℃灭菌20min，备用[24]。
2.2.2乳酸-石炭酸棉兰染色液配制取苯酚10g，乳酸10g，甘油20g，棉兰0.05g，蒸馏水10mL，将苯酚置于水浴中加热至结晶溶解，然后加入乳酸、甘油和棉兰混匀，即可[25]。
2.2.3菌种分离称取“2.1”项下筛选出的最佳发酵酒曲10g，加入90mL无菌水中，置恒温振荡箱中以180r/min振荡30min，混匀。无菌操作下移取200μL，接种到PDA培养基上，置于30℃霉菌培养箱中培养2～3d，分离纯化菌株。并用30%甘油水溶液20℃冻存[26]。
2.2.4菌种鉴定
（1）传统菌落形态观察：将保藏于30%甘油水溶液中的菌种用接种环接种于PDA培养基上，然后置于30℃霉菌培养箱中培养2～3d，观察菌落形态[27]。分离纯化出具有根霉典型特征的菌株1株，菌种在PDA平板上30℃培养48h后，培养基表面长出白色透明菌丝，60h后，白色菌丝长满整个培养基表面，白色，繁密，呈棉絮状，并生长许多黑色孢子。结果见图1。
（2）显微结构观察：采用插片培养法，将菌种接种于PDA平板培养基上的盖玻片与培养基交界处，置于30℃恒温培养箱中培养，待菌丝生长附着到盖玻片上，用无菌镊子拔取盖玻片，经乳酸-石炭酸棉兰染色液染色后，置于显微镜下观察真菌结构[28]。显微镜下显示菌丝无隔膜，具分枝和假根，顶端有孢子囊，孢子囊近似球状，孢子呈球形或近似球状。结果见图2。
2.3纯菌种发酵百药煎工艺研究
2.3.1菌种活化及孢子混悬液的制备[30-31]将菌种活化于PDA平板培养基上，培养3～4d待菌落长满平板时，用10μL接种环刮取4环孢子置于含100mL无菌水的锥形瓶（内含玻璃珠）中，置于30℃、180r/min的恒温振荡箱中振荡混匀2h，将孢子混悬液浓度稀释至1×108个/mL。
2.3.2菌丝球质量的测定吸取上述孢子混悬液5mL，置于含60mL马铃薯葡萄糖培养基的锥形瓶中，180r/min、30℃振荡培养10d，每天取2份，迅速恢复到室温，使用抽滤装置，用已恒定质量的滤纸滤过并收集菌丝球，将滤后的菌丝球反复用蒸馏水冲洗数次，将上述洗净后的菌丝球连同滤纸于60℃的烘箱中充分烘干至恒定质量，用电子天平称其干质量[32]。振荡培养1～2d，菌种生长速率最快，日生长量最高达到334.0mg；培养2～4d菌丝球质量相对稳定，日生长量逐天降低；菌种培养到第5天后，培养液开始发黄并渐变红，菌丝球质量出现负增长，应是营养物质的大量消耗，使得营养物质比例失调，不利于菌种生长，开始产生有害物质。因此选择第4天作为最佳接种天数，微生物生长速度快，代谢旺盛，细胞代谢产物积累达到最高峰，酶系活跃。结果见图4。
2.3.3单因素试验
（2）不同发酵温度对百药煎中没食子酸含量的影响：分别在28、30、32、34℃，相对湿度85%的条件下发酵48h，结果见表3。在30℃下发酵，百药煎中没食子酸含量最高，达41.00%。
（3）不同菌种接种量对百药煎中没食子酸含量的影响：分别添加5%、7%、9%、11%菌种，在30℃、相对湿度85%的条件下发酵48h，结果见表4，菌种接种量为9%时，没食子酸含量最高，达41.40%。
2.3.4百药煎中5种成分含量测定方法的建立
（1）色谱条件：色谱柱为WatersSymmmetryShieldTMRP18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液，梯度洗脱：0～40min，10%～16%乙腈；40～41min，16%～18%乙腈；41～55min，18%～19%乙腈；55～75min，19%～24%乙腈；75～90min，24%～10%乙腈；体积流量0.8mL/min；检测波长280nm；柱温30℃；进样量6μL。
（2）供试品溶液的制备：精密称取纯菌种发酵百药煎样品（过4号筛）0.2g，置100mL锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定质量，放置2h，超声提取40min，放凉30min，补足减失的质量，滤过，取续滤液，过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液。
（3）混合对照品溶液的制备：精密称取没食子酸甲酯对照品5.13mg，置于5mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成质量浓度为1.026mg/mL的没食子酸甲酯对照品溶液。另精密称取没食子酸对照品7.64mg，()-表没食子儿茶素对照品5.29mg，TGαG、TGβG对照品各2.15mg，并精密移取上述没食子酸甲酯对照品溶液0.5mL，置于同一5mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液1。精密移取1mL混合对照品溶液1置于5、10mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液2、3；从混合对照品溶液2中精密移取1mL置于5mL量瓶中，同上操作，作为混合对照品溶液4；从混合对照品溶液3中精密移取1mL置于5mL量瓶中，同上操作，作为混合对照品溶液5，制成系列质量浓度的混合对照品溶液。
（4）线性关系考察：分别精密吸取系列质量浓度的混合对照品溶液6μL，注入液相色谱仪，按“2.3.4（1）”项下色谱条件测定，以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程：没食子酸Y＝3142774X＋133903，R2＝0.9999，线性范围98.3～7962.6ng；()-表没食子儿茶素Y＝185295X－7156，R2＝0.9999，线性范围242.6～3882.2ng；没食子酸甲酯Y＝342220X－16945，R2＝0.9998，线性范围12.3～618.0ng；TGαGY＝1056954X－34385，R2＝0.9993，线性范围48.9～1270.5ng；TGβGY＝1717844X－58584，R2＝0.9993，线性范围48.9～1270.5ng。
（5）精密度试验：取纯菌种发酵百药煎样品1份，按“2.3.4（2）”项下方法制成供试品溶液，按“2.3.4（1）”项下色谱条件连续进样6次，记录各成分峰面积，计算其RSD值，检验仪器精密度。结果没食子酸、()-表没食子儿茶素、没食子酸甲酯、TGαG、TGβG峰面积的RSD分别为0.16%、0.33%、3.76%、2.92%、1.00%，结果表明该仪器精密度良好。
（6）稳定性试验：取同一纯菌种发酵百药煎样品1份，按“2.3.4（2）”项下方法制成供试品溶液，按“2.3.4（1）”项下色谱条件，分别于制备后0、3、6、9、12、24h进样分析，记录各成分峰面积，计算其RSD值，检验供试品溶液制备方法的稳定性。结果没食子酸、()-表没食子儿茶素、没食子酸甲酯、TGαG、TGβG峰面积的RSD分别为0.20%、0.99%、4.62%、4.35%、3.44%，结果表明供试品溶液在24h内稳定。
（7）重复性试验：精密称取同一纯菌种发酵百药煎样品6份，按“2.3.4（2）”项下方法制成供试品溶液，按“2.3.4（1）”项下色谱条件测定，记录各成分峰面积，计算其质量分数及RSD值。结果没食子酸、()-表没食子儿茶素、没食子酸甲酯、TGαG、TGβG质量分数的RSD分别为1.31%、2.98%、4.79%、1.93%、4.01%，结果表明该方法重复性良好。
（8）加样回收率试验：精密称取已测知5种成分含量的百药煎样品0.1g，平行称定6份，分别加入质量浓度为8.23mg/mL的没食子酸对照品溶液1.44mL，质量浓度为1.81mg/mL的()-表没食子儿茶素对照品溶液1.13mL，质量浓度为1.12mg/mL的没食子酸甲酯对照品溶液0.80mL，质量浓度为0.92mg/mL的TGαG照品溶液0.26mL，质量浓度为0.92mg/mL的TGβG照品溶液0.26mL，按“2.3.4（2）”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.4（1）”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率。结果没食子酸、()-表没食子儿茶素、没食子酸甲酯、TGαG、TGβG的平均加样回收率分别为98.93%、98.85%、96.98%、98.16%、97.90%，RSD分别为0.12%、0.33%、3.32%、2.13%、3.67%，结果表明该方法的准确度良好。
（9）含量测定：按“2.3.4（2）”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.4（1）”项下色谱条件进行测定，计算百药煎样品中5种成分含量。混合对照品及百药煎样品的HPLC图见图5。
3讨论
本实验建立了稳定的百药煎纯菌种发酵工艺，提高了发酵效率，但与传统自然发酵的百药煎在药理作用、药效物质基础等方面是否存在差异，仍需进一步研究。