导读：刚刚，国家药监局器审中心发布《重组人源化胶原蛋白原材料评价指导原则（征求意见稿）》
重组人源化胶原蛋白原材料评价指导原则
（征求意见稿）
本指导原则旨在指导注册申请人对植入类医疗器械所用重组人源化胶原蛋白原材料进行充分的研究，并整理形成产品注册申报资料，同时也为技术审评部门对重组人源化胶原蛋白制成的产品注册申报资料包括所引用主文档内容的技术审评提供参考。本指导原则主要针对植入类医疗器械的重组人源化胶原蛋白原材料的评价，其它医疗器械用重组胶原蛋白原材料的评价也可以参考本指导原则适用的部分。
一、前言
重组人源化胶原蛋白仅是重组胶原蛋白的一类，材料特性并不能完全决定最终产品的安全性和有效性。本指导原则中的“原材料”是指用于生产制造医疗器械用的重组人源化胶原蛋白材料。
二、评价要点
（一）重组人源化胶原蛋白原材料性能研究
需根据不同的预期用途及使用部位、不同生产工艺、预期使用效果和最终医疗器械的状态，选择适用的指标；根据胶原蛋白材料是否经过交联或化学修饰，宜提供交联剂或修饰剂的残留量、降解周期等性能的检测指标，提供相应的检测报告。
检测的必要性和纯度等指标要求取决于胶原蛋白材料性质和用途、生产和纯化工艺及生产工艺的经验等多种因素。新的分析技术及对现有技术的改进正在不断进行，适当时应使用这些新的技术。
1.鉴别
1.1氨基酸序列及覆盖度
首先需明确氨基酸序列的选择依据，如为特定氨基酸序列片段组成的，还需明确片段重复次数及依据。需采用综合的方法测定目标胶原蛋白材料的氨基酸序列，并与其基因序列对应的理论氨基酸序列进行比较验证。肽段覆盖率的检测结果应为100%覆盖，末端氨基酸序列检测结果应与理论序列完全一致。
1.1.1氨基酸组成
使用各种水解法和分析手段测定氨基酸的组成，并与目的蛋白基因序列推导的氨基酸组成或天然异构体比较。如需要时应考虑分子量的大小。多数情况下，氨基酸组成分析对肽段和小蛋白可提供有价值的结构资料，但对大蛋白一般意义较小。在多数情况下，氨基酸定量分析数据可用于确定蛋白含量。
1.1.2氨基酸末端序列
氨基酸末端分析用于鉴别N-端和C-端氨基酸的性质和同质性。若发现目的胶原蛋白材料的末端氨基酸发生改变时，应使用适当的分析手段判定变异体的相应变异数量。应将这些氨基酸末端序列与来自目的胶原蛋白基因序列推导的氨基酸末端序列进行比较。用氨基酸序列分析仪或质谱法测定N端和/或C端氨基酸序列，其结果应符合理论预测（每年应至少做一次）。
1.2肽图
按照《中华人民共和国药典》四部通则肽图检查法第一法胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法进行测定，建立胶原蛋白材料标准肽图。
应用合适的酶或化学试剂使所选的材料片段产生不连续多肽，应用HPLC或其他适当的方法分析该多肽片段。应尽量应用氨基酸组成分析技术，N-末端测序或质谱法鉴别多肽片段。对材料成品放行来说,经验证的肽谱分析经常是确证目的材料结构/鉴别的适当方法。
1.3分子量
高分辨质谱法分子量应与参比品一致；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分子量电泳条带位置应与参比品一致。
1.4等电点
按照《中华人民共和国药典》四部通则电泳法第六法（等电聚焦电泳法）或0542毛细管电泳法进行检测，等电点应在标示范围内，也可以运用其他适当的方法测定。
1.5巯基和二硫键
如果目的胶原蛋白材料的基因序列存在半胱氨酸残基时，应尽可能确定巯基和/或二硫键的数量和位置。使用方法包括肽谱分析（还原和非还原条件下）、质谱测定法或其他适当的方法。
1.6碳水化合物结构
应测定糖蛋白中碳水化合物含量（中性糖、氨基糖、唾液酸）。此外，尽可能分析碳水化合物的结构、寡糖形态（长链状）和多肽的糖基化位点。
1.7消光系数（或克分子吸光度）
多数情况下，可取目的胶原蛋白材料于UV/可见光波长处测定消光系数（或克分子吸光度）。消光系数的测定为使用UV/可见光或分光光度计检测已知蛋白含量的溶液，蛋白含量应用氨基酸组成分析技术或定氮法等方法测定。
1.8电泳图型
应用PAGE电泳、等电聚焦、SDS－PAGE电泳、免疫印迹、毛细管电泳法或其他适当的方法,获得目的胶原蛋白材料的一致性,同一性和纯度的电泳图谱和数据。
1.9液相层析图谱
应用分子筛层析、反相液相层析、离子交换液相层析、亲和层析或其他适当方法，获得目的胶原蛋白材料的一致性、同一性和纯度的层析图谱和数据。
2.结构表征
2.1氨基酸异质性分析
2.1.1脱酰胺化、氧化、糖谱/糖基化修饰等
适用时，应按YY/T1849《重组胶原蛋白》中的要求进行分析。
2.1.2脯氨酸羟基化
若在设计是进行脯氨酸羟基化，应按YY/T1849《重组胶原蛋白》中的规定进行分析，并规定标示值。
2.2高级结构分析
2.2.1三螺旋结构
可采用圆二色谱在特定实验条件下的检测结果反映胶原蛋白材料在该条件下可（否）具有形成三螺旋结构能力；可采用X射线晶体学技术或冷冻电镜技术在原子结构水平考证胶原蛋白材料或其包含的特定氨基酸序列的三螺旋结构特性，计算有结构信息的序列占整个蛋白序列的百分比X%；可采用差示扫描量热谱检测胶原蛋白材料结构变化的热效应辅助说明胶原蛋白的高级结构特征；可采用红外光谱进行结构分析，其非特征区（如：酰胺a、b）和特征区（如:酰胺I、酰胺II、酰胺III）的特征峰位置应与参比品一致；可采用拉曼光谱，其拉曼光谱图应与参比品一致；也可应用其它紫外或可见光吸收光谱法、核磁共振（NMR）等适当的方法检测。
2.2.2纤维质量/多孔网状结构
适用时，使用TEM或AFM观察胶原蛋白材形成胶原纤维束/多孔网状结构等，须明确两种方法具体的制样和观察测定过程。
3.纯度
关于纯度的要求可视医疗器械终产品的用途和用法而确定，作为原材料，建议一般应≥95%。
4.含量
应建立重组人源化胶原蛋白含量检测方法，含量以质量/重量或质量/体积表示。含量检测可通过液相色谱法（HPLC）、凯氏定氮法、特征多肽法等，应在标示量的90%～110%之间。
5.杂质、污染物和添加剂
5.1源于细胞基质的杂质
5.1.1外源性DNA残留量
按照《中华人民共和国药典》“外源性DNA残留量测定法”的“荧光染色法”或“定量PCR法”进行测定，“荧光染色法”的样品加标回收率应满足70%～130%；“定量PCR法”的样品加标回收率应满足50%～150%，应规定残留限量。如果样品中外源性DNA残留量低于“荧光染色法”的检测限，则应采用“定量PCR法”进行测定。
宜根据医疗器械产品的预期临床用途（作为植人物在体内使用，还是作为敷料等在体表、粘膜使用）、使用量等，确定含重组胶原蛋白的材料临床最大使用量的外源性DNA残留量限值。如果重组胶原蛋白产品预期为体内植人剂，推荐参考生物制品外源性DNA残留限量要求，结合残留DNA宿主类型及其风险程度设定每人每次最大使用量限值。
建议参考生物制品中大肠杆菌或酵母菌表达的基因工程重组生物制品的外源性DNA残留量限度，如注射用生物制品≤10ng/剂，CHO细胞表达的基因工程重组产品外源性DNA残留量≤100pg/剂(10000IU）等。
5.1.2宿主细胞蛋白质残留量
按照《中华人民共和国药典》“大肠埃希菌菌体蛋白质残留量测定法”或采用经验证的酶联免疫试剂盒进行测定，其结果应在总蛋白的0.05%以下（体内植人）。
按照《中华人民共和国药典》“酵母工程茵茵体蛋白质残留量测定法”或采用经验证的酶联免疫试剂盒进行测定，其结果应在总蛋白的0.05%以下（体内植入）。
采用经验证的酶联免疫试剂盒进行测定，CHO细胞蛋白质残留量应在总蛋白的0.05%以下（体内植入）。
5.1.3促炎性污染物（肽聚糖）
采用经验证的方法或经验证的市售细菌肽聚糖检测试剂盒（ELISA）检测残留肽聚糖，应根据其致热反应风险规定可接受的限量要求。
5.2源于培养基的杂质
残余抗生素含量的测定按照YY/T1849《重组胶原蛋白》中描述的方法或其他经验证的方法进行检测，残余抗生素活性按照《中华人民共和国药典》四部通则生物活性测定法中抗生素微生物检定法或《中华人民共和国药典》四部通则抗生素残留量检查法进行检测。
5.3源于下游工艺产生的杂质
5.3.1添加剂
如果使用了防腐剂、冻干保护剂等添加剂，应给出其限量要求和检测方法。
5.3.2重金属及微量元素含量应符合以下规定。
对工艺中添加的重金属元素，应符合规定限值。
重金属总量（以Pb计）应≤10μg/g。
微量元素含量：砷（As）≤1μg/g，汞（Hg）≤4μg/g，铅（Pb）≤10μg/g，铬（Cr）、镉（Cd）、铜（Cu）、钼（Mo）、铁（Fe）、镍（Ni）总量应≤50μg/g。
5.4细菌内毒素
5.5微生物限度
5.6无菌性
若胶原蛋白材料以无菌状态提供，按照《中华人民共和国药典》四部通则无菌检查法进行检测，结果应无菌。
6.分子变异体
6.1化学修饰类型
应考虑脱酰胺、异构化、错配S-S连接和氧化形式的分离和鉴别。对这些变异体的分离和鉴别，可应用层析法和/或电泳法（如HPLC、毛细管电泳、质谱法、圆二色谱）。
6.2降解物和聚合体
降解物和聚合体：聚合体包括二聚体和多聚体，可用分子筛层析法（如SE-HPLC）进行定量；应建立降解物的判定标准，并对稳定性试验产生的降解产物进行监测。
7.热稳定性
如果重组胶原蛋白是多聚体，可采用差示扫描量热分析（DSC）进行解聚温度分析。可参考《中华人民共和国药典》四部。
如果是单链的蛋白肽，可参考《中华人民共和国药典》四部,人免疫球蛋白3.3.2.4热稳定性试验，将供试品置（57±0.5）℃水浴中保温4h后，用可见异物检查装置，肉眼观察应无凝胶化或絮状物。
8.降解特性及产物
应对胶原蛋白材料降解特性进行研究，可采用GPC测定降解产物的分子量分布及分子量，水解/酶解产物可使用氨基酸分析仪、高效液相色谱或其他适宜的方法测定。
9.其它理化指标
9.1外观（如性状、颜色）
用肉眼直接观测，应为白色/淡黄色/无色透明液体或凝胶，或白色/类白色冻干粉或海绵状固体。
注：随着行业发展，可能存在其他外观要求，应根据原材料具体形态规定外观要求。
9.2可见异物
按照《中华人民共和国药典》四部通则可见异物检查法第一法（灯检法）进行检测，应无明显异物。
9.3溶解性
应根据供试品的溶解特性，对供试品在水、稀酸或中性盐溶液中的溶解程度进行表征和阐述。称取适量样品，于25℃±2℃一定体积的溶剂中，每隔5min强力振摇30s；观察30min内的溶解情况，如无目视可见的溶质颗粒或液滴时，即视为完全溶解。
表7水溶解性/盐溶解性
溶解度
指标要求
难溶（mg/mL）
＜0.1
微溶（mg/mL）
0.1-10
可溶（mg/mL）
10-100
易溶（mg/mL）
＞100
9.4水分
适用时（如冻干样品），水分含量应≤10%。除另有规定外，取供试品约1g～2g，按照《中华人民共和国药典》“水分测定法”第二法（烘干法）测定，或取供试品约10mg按照《中华人民共和国药典》“热分析法”热重法（TG）测定，升温程序：从室温以10℃/min速率升温至105℃，保持60min。减失重量应符合所标示范围。规定仲裁方法为水分测定法。
9.5炽灼残渣
除另有规定外，取1.0-2.0g，按照《中华人民共和国药典》四部通则炽灼残渣检查法进行检测，结果应≤2%。
9.6酸碱度
液体和凝胶样品直接取样，固体样品用生理盐水稀释为1mg/mL，按照《中华人民共和国药典》四部通则“pH值测定法”进行检测，应符合所标示值的±1.0，一般应在5.5-8.0之间。
9.7渗透压摩尔浓度
液体和凝胶样品直接取样，固体样品用生理盐水稀释为1mg/mL按照《中华人民共和国药典》四部通则渗透压摩尔浓度测定法进行检测，渗透压摩尔浓度范围应280-360mOsmol/kg之间。
9.8动力黏度（凝胶）
取供试品按照《中华人民共和国药典》“黏度测定法”的“旋转黏度计测定法”测定，需要详细描述试验条件，动力黏度值应符合所标示范围。
9.9装量及差异
根据供试品性状（溶液、凝胶、冻干海绵或冻干粉末等）和装量的不同确定装量的允差要求。单个装量不低于标示装量的93%,平均装量不低于标示装量。
9.10扫描电镜观察
适用时，重组人源化胶原蛋白固体在扫描电镜下观察，图像整体应与参比品保持一致。
10.生物学功能评价
细胞在体内对基于胶原蛋白-细胞相互作用通过生物化学和生物物理两个方面进行调控。胶原蛋白固有的细胞信号传导能力在很大程度上受以下三个方面驱动：支持整合素介导的细胞粘附；通过结构和材料特性施加物理和机械的作用；参与细胞诱导的动态重建过程（如生物降解，结合生长因子，和微结构的变形）。
由于胶原类材料在分子组成、微结构、物理性能方面可能差异显著，应检测材料与细胞之间相互作用及其引导细胞基础响应的性能。细胞响应的参数包括：细胞形态、面积和体积，均可通过二维（2D）或三维（3D）图像技术可视化评价。细胞骨架成分（如肌动蛋白）的协同作用被用来评价细胞与基质间的粘附与收缩解离。
测试过程中，在胶原聚合之前通过把细胞混悬在胶原溶液中，细胞很容易进入自组装胶原网内，或者将细胞接种到自组装后的胶原材料表面。抗体阻断试验可用来确定细胞表面的何种受体参与了与胶原的作用，如整合素或盘状结构域受体（DDRs）。
常规检测的细胞响应参数还包括：存活率，增殖率，程序化凋亡以及迁移。
其它适用于干细胞和祖细胞类型的细胞-胶原相互作用的功能性检测包括细胞株的定向分化，特定干细胞或祖细胞的增殖，或组织形态发生（始于内皮祖细胞的血管形成）。
按照《中华人民共和国药典》四部进行成纤维细胞生长因子生物学活性测定，对胶原蛋白肽-细胞相互作用评价，反映胶原蛋白肽与成纤维细胞增殖的构效关系。按照《中华人民共和国药典》四部生物活性测定法对试验结果进行统计学分析，包括对验证指标结果的绘图和统计学分析，以及判断其是否符合可接受标准等。常规的统计学方法一般要求数据之间相互独立，并呈近似正态分布和方差齐性，通常采用相对效价的对数转换值进行数据分析。当无法满足上述统计学要求时，也可考虑采用其他适宜的替代方法进行数据分析。
上述关于胶原—细胞相互作用的功能性测定也可作为医疗器械产品标准化和质量控制的方法。三维支架材料中细胞活性评价方法可参考YY/T1562《组织工程医疗器械产品生物材料支架细胞活性试验指南》。
（二）材料免疫学安全性研究
临床前安全性评价包括临床前安全性试验，其目的主要是确定新胶原蛋白材料是否会在人体引起未能预料的不良反应，免疫学安全性研究是重组胶原蛋白材料生物安全性研究资料的主体。但是，用传统生物试验方法来评价重组胶原蛋白往往有困难，并受多种因素的影响。例如高度的种属特异性，人的蛋白质对人的生物学活性远高于对动物的活性，而且人的蛋白质氨基酸序列，常常与来自其它种系的蛋白质不同，例如糖基。因而由基因工程技术所制备的蛋白质或肽类往往会在人体以外的其它宿主中产生免疫应答，其生物学效应有所改变，并可能因形成免疫复合物而导致有毒性反应，而这样产生的毒性反应与人体安全性显然无关。
1.免疫原及免疫化学检验
基于部分人胶原蛋白核酸序列进行编辑组合而重组的蛋白质产物，特别是长期反复使用时，可能引起人体预测不到的免疫原性。因此，不能完全排除其免疫原性风险，宜增加免疫学研究。重组人源化胶原蛋白作为医疗器械用原材料，可采用适宜方法进行免疫学评价。若用动物进行免疫学试验，可能因为动物模型与临床应用之间存在种属差异，带来对评价试验结果或评价试验数据使用上的局限，应当根据临床试验获得的免疫学评价数据及动物模型获得的免疫评价数据进行综合评价分析。
杂蛋白的检测可参考YY/T1453《组织工程医疗器械产品I型胶原蛋白表征方法》，外源性DNA检测可参考YY/T0606.25《组织工程医疗产品第25部分动物源性生物材料DNA残留量测定法：荧光染色法》。胶原蛋白材料的免疫原检验可通过流式细胞术（FCM）或酶联免疫吸附法（ELISA）测定，检测试验宜考虑，但不限于淋巴细胞增殖试验（YY/T0606.15《组织工程医疗产品第15部分评价基质及支架免疫反应的实验方法：淋巴细胞增殖试验》）、细胞迁移试验（YY/T0606.20《组织工程医疗产品第20部分：评价基质及支架免疫反应的试验方法：细胞迁移试验》），采用非标方法时应进行方法学验证。
申请人应提供支持该检测法的全面验证的数据。验证包括证明用于给定样品中抗体的定量测量的特定检测法对于预期用途是可靠和可重现的。抗体检测法有助于评价材料的免疫原性，然而抗体的检测依赖于检测法的关键操作参数（如灵敏度、专属性），一般来说，建议申请人开发针对灵敏度、专属性、选择性、精确度、重复性和稳定性进行优化后的检测法。
其他的免疫原评价及生物学性能及生物相容性评价等建议做医疗器械终产品的检测，因为加工工艺不同最终产品性能不同，例如有些交联工艺可能会封闭某些免疫原反应簇等等。
2.免疫毒理学评价
当拟生产医疗器械免疫原性风险与已上市产品无可比性，且无充分的文献数据评价其免疫原性，需进行免疫毒理学试验研究。通过免疫毒理学试验，对炎症反应、免疫抑制、免疫刺激、超敏反应以及自身免疫进行确证评价，评估免疫系统改变导致的潜在人体不良健康作用。
免疫毒理学可通过流式细胞术（FCM）、酶联免疫吸附法（ELISA）、组织病理切片等方法测定，试验方法可考虑结合生物学试验、体外T淋巴细胞转化试验（YY/T1465.1《医疗器械免疫原性评价方法第1部分体外T淋巴细胞转化试验》）等，申请人应对选用检测方法的适用性进行评价，采用非标方法时应进行方法学验证。
可参考GB/T16886.20《医疗器械免疫毒理学试验原则和方法》选择性进行功能性或非功能性免疫毒理学试验，通过啮齿动物试验方式检测和评价物质的不良作用。目前主要研究方法是将医疗器械/材料植入小鼠/模式小鼠，然后研究器械/材料整个降解周期内机体的体液和细胞的免疫应答，以及局部组织的免疫反应。功能性检测测定细胞和/或器官活性，例如淋巴细胞对有丝分裂原或特异性抗原的增殖反应、细胞毒活性和特异性抗体的形成；非功能性检测涵盖形态学方面和/或定量的术语、淋巴组织变化程度、淋巴细胞数目和免疫球蛋白水平或其他免疫功能标志物。
（三）材料生物学风险评价
首先根据YY/T0316《医疗器械风险管理对医疗器械的应用》描述的风险管理过程进行生物学风险评定，建议考虑预期使用/器械表征，识别材料、添加剂、加工助剂和其他潜在可沥滤物中的危害，接触剂量等因素，绘制基于风险管理的生物学评价流程图。对器械的生物学风险进行逐一评估，并详述风险控制措施。
如果医疗器械产品以非灭菌的方式提供，可将样品灭菌后用于生物学评价试验，宜考虑灭菌方式及灭菌对重组胶原蛋白的影响。
可能需要评价的生物学风险评定终点包括：
1.细胞毒性
2.致敏性
注射胶原、胶原止血剂等具有潜在生物可降解性材料或体内植入材料以及材料制备过程中新增化学成分和制造加工助剂、装配粘合剂/溶剂残留物以及灭菌残留物或灭菌过程所致的反应性产物可能存在于成品时需进行迟发型超敏反应试验。
3.皮肤刺激性
伤口修复材料、胶原蛋白敷料等直接与皮肤表面、伤口或其他损伤部位接触材料需进行皮肤刺激试验。
4.皮内反应
注射胶原、胶原止血剂等具有潜在生物可降解性材料或体内植入材料以及材料制备过程中新增化学成分和制造加工助剂、装配粘合剂/溶剂残留物以及灭菌残留物或灭菌过程所致的反应性产物可能存在于成品时需进行皮内刺激试验。
5.材料介导的致热性
6.全身毒性
7.溶血性
血管修复材料、创伤和烧伤修复材料、胶原止血剂、心脏瓣膜等与循环血液接触的外部接入材料和大部分植入材料以及全部植入血管系统材料需进行溶血试验。
8.植入反应
皮下植入（胶原支架、血管修复材料、创伤和烧伤修复材料、胶原止血剂等可降解/可吸收材料或需植入生物材料等需进行皮下组织植入试验进行评价）；肌肉植入；骨植入。
9.遗传毒性。
（四）稳定性研究与直接接触性容器/材料研究
1.稳定性研究
研究中需对能够反映质量变化的敏感特征进行研究，如含量、完整性、纯度、微生物安全性和生物学活性等。研究中需涵盖拟定的各项条件，如温度、光照、反复冻融（冷冻贮存时）、振摇等方面。根据实际使用情况，开展使用中稳定性研究，例如复溶或解冻，与复溶稀释剂的相容性等研究。研究中需采用与实际使用相同材质的直接接触性容器/材料。
2.直接接触性容器/材料研究
如涉及贮存，需对直接接触的包装容器开展相应的包材相容性研究。根据相容性研究结果，结合稳定性研究，选择合理的包装容器。
另外，对制备工艺中与样品接触的容器和一次性使用材料（如贮存袋、过滤膜、层析介质、管路等），需开展风险评估和/或相应的相容性研究。
三、参考文献
四、起草单位
国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心
重组人源化胶原蛋白原材料制造过程控制
主要包括工程细胞构建过程、生产用细胞的质量控制及常规生产过程控制。
一、重组工程细胞构建及生产用细胞的质量控制
重组人源化胶原蛋白属于采用重组DNA技术，对编码所需人胶原蛋白的基因进行遗传修饰，利用质粒将目的基因导入适当的宿主细胞，表达并翻译成蛋白质，经过提取和纯化等步骤制备而成的具有生物学活性的胶原蛋白之一。
1.工程细胞的构建
经过全面检测的种子细胞是实现重组胶原蛋白材料生产的前提和基础。生产用种子细胞应具有共同的始祖细胞，保持相同的遗传和生物学特征，在特定的培养环境和条件下持续稳定表达携带的外源目的基因。建议详细阐述共同始祖细胞的判定标准。只有经过研究确定细胞在扩增培养和生产过程中的变化，才能够有效控制风险性因素，满足生产的持续需求，使胶原蛋白材料质量保持一致。
需阐述宿主细胞的基本特征，如形态、培养和生长一般特征、培养条件和培养液要求，新构建的细胞系应检测致瘤性特征。对宿主系统（原核、真核、哺乳细胞等）的特性、遗传背景、基因型、表型、抗性、质粒转化条件特征都应有详细的文献或实验资料。举例如表1。
表1宿主细胞基本特征信息表
细胞株名称
ChineseHamsterOvary(CHO)
Pichiapastoris
Escherichiacoli
出品公司
sigma
Invitrogen
宿主系统类型
中国仓鼠卵巢细胞
毕赤酵母GS115
大肠杆菌BL21(DE3)
生长条件
36.5℃,有氧
28℃,有氧
37℃,有氧
质粒转化条件
电转
基因型
Wildtype
His4
F-ompThsdSB(rB-mB-)galdcmrne131(DE3)
1.2宿主细胞鉴定
宿主细胞（原核、真核、哺乳细胞等）污染和营养缺陷表型(或基因敲除)、过表达及导入外源基因等鉴定检测方法都应有详细的文献或实验资料。举例如表2。
表2宿主细胞鉴定项目
检测项目
检测方法
质量标准
污染
平板划线，显微镜检测、支原体检测试剂盒
无污染
营养缺陷表型鉴定
营养缺陷平板生长鉴定
不生长
甲醇利用性
含甲醇的平板生长鉴定
符合菌株表型
导入外源基因鉴定
PCR扩增，产物测序
符合菌株基因型
过表达基因鉴定
qPCR检测过表达基因转录水平
工程细胞的构建一般包括基因获得、质粒构建和表达体系构建三个阶段。举例如图1。
图1工程细胞构建一般流程
目前可采用多种表达载体、宿主细胞、基因导入方法和筛选标记等进行工程细胞的构建和筛选，构建成功的标志是工程细胞能够稳定、高效地表达结构正确且具有生物活性的目的产物。因此，应尽可能提供关于重组工程细胞构建和鉴定的详细资料，重点描述的内容举例如表3。
表3工程细胞鉴定项目
工程质粒线性化
核酸电泳法
单一条带，大小正确
线性质粒纯化
紫外分光光度扫描
DNA浓度不低于100ng/μL；OD260/280=1.8~2.0
转化表达受体细胞
平板筛选，PCR扩增产物测序
测序结果正确
表达鉴定
SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染色法
分子量符合预期
免疫印迹法
水解氨基酸测定
氨基酸组成正确
表达筛选
SDS-PAGE/Westernbloting/酶联免疫吸附法（酵母除外）
按表达量前5%选择
表4衡量目的基因质量的项目
检查项目
目标序列
DNA测序
限制性酶切
插入片段大小正确，无预期外片段
DNA质量
OD260/280=1.8~2.0
1.3.2载体选择与重组质粒的构建
图2完整的质粒信息示例
将目的基因序列插入质粒中时，为保证重组质粒构建正确，应提供重组质粒至少含目的插入基因完整开放读码框的测序报告，并提供测序序列与设计序列的比对结果，二者应一致。需提供插入基因和表达载体两侧端控制区的核苷酸序列。所有与表达有关的序列均应详细叙述。主要质量控制参数举例：
表5目的基因序列插入质粒过程中的主要质控参数举例
限制性酶切验证
应明确质粒与菌种/细胞的储存条件，例如质粒溶液为-20℃，甘油菌为-80℃，等等。
1.3.3载体引入宿主细胞的方法及重组工程细胞的筛选
需详细说明载体引入宿主细胞的方法和操作过程，重组工程细胞的筛选原理、条件和标准，以及采用何种方法增加基因拷贝数等。阐述外源基因引入宿主细胞后产生的变化，符合筛选标准的候选细胞可能为多个细胞株，但拟用于建库的细胞株应为经研究比较后确定的单一细胞克隆。
非病毒载体类基因修饰系统可通过物理、化学或生物转导方式递送进入细胞。进入目的细胞后，通过转录、剪切、翻译等方式发挥作用。
若采用基因编辑系统，建议对靶向序列、目的基因序列和基因编辑用酶等的序列和比例等进行优化。通过特定细胞中的基因编辑效果确认基因编辑用酶和靶向序列的特异性，筛选最佳的靶向结合序列（如sgRNA序列），并采取措施降低基因脱靶、插入突变的概率及对目的细胞基因组稳定性的不良影响。对于转座子系统，建议考虑整合位点的特异性和分布趋势，以及转座子在基因组中的移动（genomicmobilization）等特征，进行转座子序列、转座酶及相应调控元件的优化，合理设置转座序列/转座酶的比例、序列分布等。
需检测重组后细胞基本性状的改变，比较研究插入外源基因后细胞致瘤性特征的改变。需说明表达载体在宿主细胞内的状态（是否整合到染色体）并采用适宜的方法测定其拷贝数，应提供宿主和载体结合后的遗传稳定性资料。说明启动和控制目的基因在宿主细胞中表达所采用的方法，并进行初步的表达产物鉴别和表达水平检测。
对于选定的工程细胞株应进行充分的目的基因全序列确认，以保证用于编码和表达目的产物的基因在初始核酸序列上的正确性。应详细叙述在生产过程中，启动和控制克隆基因在宿主细胞中的表达所采用的方法及表达水平。
1.3.4合成表达系统制备过程中关键质量控制
此过程的质量研究通常包括鉴别、结构特征、理化特性、生物学活性、纯度和杂质分析等，建议采用多个代表性批次开展研究。
建议开展分子量、核酸浓度/含量、修饰位点及比例（如有）、物理特性（如pH、渗透压）等方面的研究。
2.生产用细胞的质量控制
2.1细胞库建立
细胞库可为三级即原始细胞库、主细胞库（MCB）和工作细胞库（WCB）；也可采用主细胞库和工作细胞库组成的两级细胞库；在某些特殊情况下，也可使用主细胞库一级库。用于建库的初始工程细胞株应为经过克隆选择而形成的均一细胞群体，必要时须经与实际生产过程所用培养基和培养条件相一致的适应性培养。
2.2建库细胞的管理
在制备工作细胞库过程中不得进行单克隆筛选，以避免由于个别基因突变引起工作细胞库中细胞群体性的遗传特性改变；为了保证细胞库中每个容器中的内容物完全一致，如培养细胞采用几个器皿的，应将所有培养皿中的细胞混合成单批后再分装。
在细胞库的建库期间应采取适宜的预防措施，以确保细胞不被污染（包括微生物污染和实验室中其他类型细胞的交叉污染等）。各级种子库的细胞应按照特定的要求经过全面检定合格后方可使用（具体要求参见本文细胞库检定）。
动物细胞库建库的具体过程、方法和管理应符合中华人民共和国药典要求。
2.3细胞库检定
正确的起始细胞是实现良好生产的前提和基础。检定的目的是为了确认经过初步筛选建库的细胞符合预期设计要求，携带有稳定的目的基因，能够持续表达有功能活性的目的产物，没有微生物污染和混杂其它细胞，能够直接扩增储备或者应用于生产。
对于原始库细胞和/或主库细胞，通常需要进行一次全面系统的研究检定，包括遗传学、生物学和微生物学，以便从源头开始严格控制起始细胞的一致性和防止污染。经过传代稳定性研究的主细胞到工作细胞，只经过简单的传代、扩增，可以适当简化检定项目，重点检测外源因子污染和防止混入了其它细胞。保存的数目和传代水平应保证生产用细胞的持续稳定供应。
2.3.1细胞鉴定
要进行目的蛋白表达稳定性分析，即确证表达产物的蛋白质序列与预期相符。
表6目的蛋白表达稳定性分析
表达稳定性
SDS-PAGE电泳考染法
与供试品一致
含量
不低于初始工程菌
污染检测
显微镜检测、支原体检测试剂盒
目前常用的方法有细胞生长特征和培养形态学检查、种属特异性抗原检测、染色体核型分析、同工酶分析、限制性内切酶分析、基因多态性分析等。应结合具体细胞固有的特性进行适宜的组合和选择，以实现正确鉴别为目的。
真核细胞用于生产时，细胞的鉴别标志，如特异性同功酶或免疫学或遗传学特征，对鉴别所建立的种子是有用的。有关所用传代细胞的致癌性应有详细报告。如采用微生物培养物为种子，则应叙述其特异表型特征。
需检测分析目的基因引入细胞后的致瘤性特征，对于阳性细胞，应研究确定致瘤性改变对胶原蛋白材料带来的安全性风险。种子批不应含有外源致癌因子。
目的基因和表达框架的确证是种子库细胞检定的重要组成部分，对于表达正确的目的产物具有先决性意义。常用的方法包括：通过PCR扩增样本DNA来进行DNA序列分析；通过限制性内切酶谱和Southern杂交来检测基因的完整性，确定目的基因的拷贝数，并检测是否有任何序列插入或缺失等。
基因序列分析资料应包括试验方案和步骤、原始的测序图、测得序列以及翻译后的氨基酸序列，同时应将实际测得序列与理论序列进行对比。清楚标注两者之间的异同。一般情况下，在原始种子阶段应确证克隆基因的DNA序列。但在某些情况下，例如传代细胞基因组中插入多拷贝基因。在此阶段不适合对克隆基因作DNA序列分析。在此情况下，可采用总细胞DNA的杂交印染分析，或作mRNA的序列分析。对最终胶原蛋白材料的特征鉴定应特别注意。
为保证胶原蛋白材料结构的正确和稳定，基因序列分析应贯穿于重组工程细胞的筛选和鉴定、细胞库的建立和检定以及生产细胞培养监控的全过程。
2.3.2微生物污染检测
应对MCB、WCB和EPC（生产终末期细胞）进行全面检查，对生产培养过程中的细胞进行监测。在进行支原体检查时，应注意同时进行培养法和指示细胞法两种方法。必要时可采用扫描电镜法检查细胞是否受到特殊微生物的污染。
2.3.2.2.1体外试验
2.3.2.2.2体内试验
通过接种乳鼠、成年小鼠、鸡胚、豚鼠、家兔或其它敏感动物来检测细胞培养物中潜伏性病毒。通常要对MCB、EPC进行体内试验。
2.3.2.2.3种属特异性病毒的检定
2.3.2.2.4逆转录病毒的检测
逆转录病毒的试验应包括感染性试验、逆转录酶(RT)检测和电镜技术检查。应采用上述方法对MCB和EPC细胞进行逆转录病毒的检测。
2.3.2.2.4.1感染性试验
应根据细胞的特性及可能存在的逆转录病毒种类选择适宜的检测方法，如XC空斑试验（XCplaque）、延时XC空斑试验、S＋L－灶点分析（S＋L－Focus）等。试验时应注意设立恰当的阴/阳性对照。
2.3.2.2.4.2逆转录酶检测
为提高检测的敏感性，通常需要将受试细胞经适当的化学诱导剂诱导后，收集上清液分别与检测细胞联合培养，再检测逆转录酶的活性，注意设立恰当的阴/阳性对照。
2.3.2.2.4.1透射电镜检查
透射电镜下可观察细胞基质超微结构的形态学特征以及逆转录病毒和病毒样颗粒的存在，应比较未经和经过化学诱导剂诱导的细胞。另外，需要对细胞培养液超速离心后所得的沉淀物经负染后进行检查。观察有无逆转录病毒颗粒以及颗粒的类型。
上述三种方法具有不同的检测特性和灵敏度。因此，应采用不同的方法联合检测。若逆转录酶活性检测阳性时，建议进行透射电镜检查或感染性试验，如果确证对人或者其它灵长类动物细胞有感染性的逆转录病毒颗粒，该细胞不可用于生产。
2.4细胞稳定性研究
2.4.1贮存条件下的稳定性
2.4.2传代/扩增过程中的稳定性
目的基因编码序列和表达框架不应有错误，包括突变、缺失、插入。并注意比较基因拷贝数的变化。
目的产物的表达量和表达活性不应有明显降低，根据不同的重组人源化胶原蛋白和具体研究结果确定适宜的可接受标准。
应重点检测细胞在传代/扩增过程中的形态、生长、代谢等基本状况，遗传特征和致肿瘤特性的变化。
2.5生产过程细胞质量控制
对于内源性逆转录病毒和/或致瘤性试验阳性的细胞，应依据工艺处理能力制定风险性成分的控制条件，并根据模拟生产状态下取得的试验研究数据制定废弃收获液的标准；生产工艺须包括有效的病毒和/或致瘤性成分的灭活/去除方法并经过充分验证。
2.5.1常规生产过程监控
经研究确定了生产工艺条件之后，常规生产过程中可重点监测微生物污染和细胞生长状况，例如活细胞数目和形态、代谢和功能状态、目的蛋白表达状况、潜伏性逆转录病毒基因组激活状况、细菌和支原体污染以及其它要求等，在比较分析的基础上确定批次或者连续培养生产的终末细胞的检测项目及可接受标准。
2.5.2细胞增殖限度
2.5.3其它风险性因素控制
2.6风险评估与控制
随着技术不断更新和研究经验的逐步积累，研发过程常常伴随重组人源胶原合成表达系统的升级和工艺的优化，因此研发各阶段有可能发生变更。系统的变更可能显著影响工程细胞的安全性和有效性，是重要风险之一，研发者需评估变更引入的影响和风险。根据风险评估情况，对重组人源胶原合成表达系统及其工程细胞的质量、工艺控制、稳定性等方面进行深入研究，合理设计变更可比性研究方案。
二、常规生产过程控制
重组胶原蛋白的结构特性容易受到各种理化因素的影响，且分离提纯工艺复杂，因此其质量控制体系是针对生产全过程，采用化学、物理和生物学等手段而进行的全程、实时的质量控制。生产过程中每一环节或制备条件的改变均可能影响其非临床安全性评价的合理性。
1.制备工艺
2．发酵
2.1有限代次生产
用于培养和诱导基因产物的材料和方法应有详细资料。培养过程及收获时，应有敏感的检测措施控制微生物污染。
需提供培养生长浓度和产量恒定性方面的数据，并应确立废弃一批培养物的指标。根据宿主细胞／载体系统的稳定性资料，确定在生产过程中允许的最高细胞倍增数或传代代次，并应提供最适培养条件的详细资料。
在生产周期结束时，需监测宿主细胞/载体系统的特性，例如质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度、含插入基因的载体的酶切图谱。一般情况下，用来自一个原始细胞库的全量培养物进行监测，必要时应做一次目的基因的核苷酸序列分析。
2.2连续培养生产
基本要求同2.1有限代次生产。
需提供经长期培养后所表达基因的分子完整性资料，以及宿主细胞的表型和基因型特征。每批培养的产量变化应在规定范围内。对可以进行后处理及应废弃的培养物，应确定指标。从培养开始至收获，应有敏感的检查微生物污染的措施。
3．纯化
根据生产工艺需求，可以将纯化过程分为粗纯、精纯、换液、浓缩等工序，关于纯度的要求可视胶原蛋白材料的用途和用法而确定。例如，仅使用一次或需反复多次使用时，用于健康人群或用于重症患者时，都可对纯度有不同程度要求。不同载体细胞表达系统可能对纯化过程的要求有所不同，但所采用的分离、纯化、浓缩方法或技术，应能适用于规模化生产并保持稳定。
对于生产过程中的收获、分离和纯化方法应详细记述，应特别注意污染病毒、核酸以及有害抗原性物质的去除，如采用亲和层析技术，例如用单克隆抗体，应有检测可能污染此类外源性物质的方法，不应含有可测出的异种免疫球蛋白。应验证这些分离、纯化关键工序及杂质检测方法。对整个纯化工艺应进行全面研究，包括对宿主细胞蛋白、核酸、糖、病毒或其它杂质以及在纯化过程中加入的有害的化学物质等的去除。可以采用过滤、离心等操作进行分离，通过洗滤参数、相对离心力等工艺参数进行必要的控制；可以采用蛋白层析或者离子交换层析等技术进行纯化。
换液可将蛋白溶剂置换至工艺要求的工作液中，浓缩将蛋白浓缩至工艺要求的浓度。质控点通常包括膜截留效率、蛋白含量、电导率等。
应建立重组人源化胶原蛋白原材料成品的鉴别、纯度、稳定性和活性等方面的试验方法，详见正文“二、（一）重组人源化胶原蛋白原材料性能研究”。对生产过程中的原液、半成品及生产原辅料，应注意如下方面。
3.1原液要求
原液的检测项目可包括蛋白表征研究（如肽段覆盖率、C端序列、N端序列、氨基酸组成、异质组成、X-射线衍射分析（XRD）、扫描电镜分析、晶体结构学研究、红外光谱、圆二色谱、差示扫描量热分析、等电点、肽图等指标）；理化性能指标检测（如鉴别、pH、蛋白含量、纯度、分子量等指标）；污染物残留指标检测（如外源性DNA残留、宿主细胞蛋白残留、糖类残留、抗生素残留、诱导剂残留、重金属总量及微量元素残留等指标）；生物性能指标检测（如微生物限度/无菌、内毒素残留、热原等指标）。基于胶原蛋白材料应用风险评估，提供研究性资料或验证报告。
3.2半成品要求
可由一批或多批原液合并生产半成品。拟混合的每批原液应在有效期内，应按规定的工艺生产、单独检验，并符合相应的质量标准；混合的各批原液应可有效追溯；应对混合工艺进行验证。
如需对半成品进行稀释或加入其他辅料，如防腐剂或赋型剂甘油、甘露醇及缓冲盐等，应确定半成品的质量控制要求，包括检定项目和可接受标准。检定项目可包括蛋白含量、pH等指标。