霉菌和霉菌毒素污染在畜禽饲料中已成为不容忽视的问题。饲料被霉菌污染后质量和营养价值降低,霉菌生长繁殖中生成毒素,后者引起畜禽的急性或慢性中毒,阻碍生长发育,甚至造成死亡;残留在动物性食品中的霉菌毒素被食入后危害人类健康。韩小敏等调查饲料原料真菌污染情况,结果显示玉米粉100%检出霉菌,共检出曲霉菌属8种、镰刀菌属3种、青霉菌属7种,其中以黄曲霉、串珠镰刀菌最常见。Shi等研究认为,霉菌毒素的主要生成菌主要有曲霉菌属、镰刀菌属、麦角菌属、链格孢属、青霉菌属。霉菌毒素是霉菌在污染饲料或谷物后在生长代谢过程中产生的有毒次级产物。全球每年约有25%的谷物受到已知霉菌毒素的污染,约2%的农作物因污染严重而失去营养及经济价值。目前已报道霉菌毒素有400多种,其中危害较大的是黄曲霉毒素、镰刀菌素、赭曲霉毒素、麦角毒素和链格孢毒素等。霉菌在温度-5~60℃,相对湿度80%以上均能生长,繁殖力强。饲料原料采购、加工、贮存过程中遇高温高湿环境,饲料极易霉变产生毒素。为防止饲料霉变,在饲料生产加工过程中适当添加防霉剂和脱霉剂,是减少饲料霉变和霉菌毒素危害的重要手段之一。
1防霉剂
防霉剂是防止饲料因微生物所致霉变或腐败的物质统称。根据我国农业部公告第2045号《饲料添加剂目录(2013)》“第8部分:防腐剂、防霉剂和酸度调节剂”和GB/T36863-2018《混合型饲料添加剂防霉剂通用要求》“附录A允许使用的防霉剂名单”,我国允许在饲料加工过程中添加的防霉剂有丙酸及丙酸盐类、甲酸、乙酸及乙酸盐类、苯甲酸及苯甲酸钠、山梨酸及山梨酸盐类。
1.1丙酸及丙酸盐类
丙酸盐为白色颗粒或粉末,无臭或稍有特殊气味,易溶于水,包括丙酸钙、丙酸铵和丙酸钠。丙酸盐的有效成分是解离后生成的丙酸分子而非盐类。丙酸盐的防霉效果受饲料中水分和pH影响。pH为7时丙酸盐仅解离出0.8%丙酸分子,当pH为4.9时游离丙酸可达到50%。丙酸盐的解离后产生大量OH-,形成弱碱环境,阻碍进一步游离丙酸分子的生产。因此,同等剂量的丙酸盐和丙酸,后者的防霉效果更好。丙酸盐不具有挥发性,对饲料混合均匀度要求高,用量大,影响饲料适口性,防霉功能受饲料含水量、pH影响,不能即时起作用。丙酸盐优点在于不挥发、耐高温、刺激性小,适合长期贮存的饲料产品。
1.2甲酸
甲酸为小分子有机酸,无色透明、有刺激性气味。相比于常用的有机酸,甲酸杀菌抑菌能力更优。甲酸作为防霉剂使用时,常与其他防霉剂复配使用。其中甲酸与植酸酶联合使用时,具有协同作用。许怀让在报道中指出在猪饲料中单独使用甲酸,猪的日增重较对照组增加10%,单独使用植酸酶,猪的日增重提高12%,两者同时添加时,日增重增加达26%。甲酸性状与丙酸类似,作为防霉剂,优缺点与丙酸近似。甲酸在饲料中添加量一般为0.6%~1.2%。
1.3乙酸及乙酸盐类
目前研究最广泛乙酸及乙酸盐类防霉剂有脱氧乙酸和双乙酸钠。脱氧乙酸为白色或淡黄色结晶粉末,对光热稳定,是一种广谱抗菌剂,对细菌、霉菌和酵母菌均有抑制作用,其中对霉菌的抑制作用最强,在不同pH下均有抗菌作用。
双乙酸钠(SDA)为白色晶状物,易吸潮,150℃以上会分解。SDA是联合国FAO/WHO组织推荐用于食品、饲料的防霉剂。SDA在饲料中加入比例在0.1%~1.5%,就可防止饲料霉变,使饲料贮存期延长3个月以上。SDA抑菌的有效成分是乙酸,乙酸分子穿透霉菌、细菌、酵母等细胞壁,作用于细胞内蛋白质,使其变性,从而抑制细胞生长繁殖达到抑菌作用。黄通旺等研究不同浓度SDA对黑曲霉、烟曲霉等11种霉菌的抑制作用,结果表明0.5%SDA可基本抑制常见的各种霉菌,0.1%SDA可以完全抑制灰绿曲霉、烟曲霉和白地霉的生长;在SDA添加饲料贮藏试验中,贮藏70d后0.1%SDA组霉菌从6.1×103降低到2.1×103,0.25%SDA组霉菌数降至0.7×103。
1.4苯甲酸及苯甲酸钠
苯甲酸为无色或白色针状或片状结晶,微溶于水。是目前使用量最大的防霉剂之一。苯甲酸钠,白色颗粒或结晶状粉末,无臭或微有安息香味,在空气中稳定,易溶于水。
苯甲酸在饲料中的添加量为0.1~0.3kg·t-1。有效防霉成分为苯甲酸活性分子,防霉作用机理为苯甲酸活性分子穿透霉菌细胞壁进入细胞内,非选择性地抑制霉菌细胞呼吸酶活性和阻碍乙酰辅酶的缩合反应,阻断能量代谢循环,使代谢受阻,从而有效抑制霉菌生长繁殖。苯甲酸及苯甲酸钠的优点是价格低、易获取、应用效果好、无残留、毒性小。缺点是对pH要求高,在pH<4作用效果更好,当pH>4时防霉作用开始减弱,有苦涩不良气味,影响适口性。
1.5山梨酸及山梨酸盐类
山梨酸盐类,多为白色或无色鳞片状结晶,无臭或微有臭味,易吸潮,溶于水,在空气中不稳定,易氧化变色。山梨酸和山梨酸盐可选择性抑制霉菌生长,对有害霉菌有抑制生长作用,对乳酸菌等有益微生物生长无影响。
2防霉剂使用
2.1防霉剂的要求
联合国FAO/WHO对防霉剂提出要求有:(1)微量添加,安全,无刺激性,不影响适口性;(2)可溶解至防霉浓度;(3)贮存稳定,性状无变化,不破坏饲料营养成分或与其他成分起反应;(4)无异味,不影响饲料适口性,如乙酸、丙酸等有机酸类易挥发,有刺激性,使饲料产生不适口感,使用相应的盐类或酯类效果更佳;(5)抑霉范围广。满足以上要求的防霉剂是优良的防霉剂。同时防霉剂在使用浓度下,无“三致”不良反应,无残留,不会引起动物急、慢性中毒。
2.2防霉剂的使用
目前防霉剂在饲料加工工艺中的使用方式分为3种,预混合时添加、混合时添加及包装袋口使用高剂量防霉剂封口。有研究使用上述3种使用方式在301、302鸡颗粒饲料中进行试验,结果表明,在预混合阶段添加防霉剂的防霉效果最佳。
3脱霉剂
3.1活性炭
活性炭是多孔不溶性粉末状物质,比表面积可达500~3500m2·g-1。Avantaggiatto等在体外消化道模型中活性炭对玉米赤霉烯酮(ZEN)、呕吐毒素(DON)及雪腐镰刀菌烯醇(NIV)均有理想吸附效率,其中活性炭添加量在2%时,使小肠对ZEN的吸收率从32%降至5%。在体内动物试验中却呈不同的试验结论,由于活性炭不能够特异性吸附,且易与饲料中营养成分吸附造成饱和吸附。Alegakis等研究发现土霉素能被活性炭强烈吸附。表明活性炭对霉菌毒素没有特异性吸附能力。
3.2硅铝酸盐类
沸石、蒙脱石、膨润土、硅藻土、高岭土等均属于天然硅铝酸盐物质,因为具有较大的比表面积和离子吸附能力,对霉菌毒素有一定的选择吸附作用而得到广泛应用和研究。沸石结构呈多孔表面,表面积约为1000m2·g-1。Kurtbay等研究发现膨润土和蒙脱石对酒中赭曲霉毒素(OTA)吸附率为40%~100%。但在实际使用中,天然硅铝酸盐类矿物质吸附力小、效率低,易吸附饲料营养物质。对天然硅铝酸盐进行改性后可提高对霉菌毒素的选择性吸附力。如水合硅铝酸钠钙对AFB1有较好的选择性吸附能力,饲料中添加0.5%的水合硅铝酸钠钙可吸附95.3%~99.1%的AFB1和84%以上的烟曲霉毒素B1。陈峰等报道水合硅铝酸钠钙对黄曲霉毒素B1的吸附试验,数据显示水合钠斑脱土对AFB1的吸附能力达80.83%,而未处理的斑脱土吸附为67.39%。
然而大量研究表明,天然硅铝酸盐和水合硅铝酸钠钙仅对AFB1有较强的吸附作用,对其他的霉菌毒素吸附能力不好,包括ZEN、OTA、T-2毒素和DON。Yiannikouris等研究硅铝酸盐吸附剂对ZEN、OTA、单端孢类毒素等吸附效果不佳,同时也会吸附饲料中其他营养物质[17]。这与硅铝酸盐吸附霉菌毒素的作用机理有关,蒙脱石、沸石等粘土类吸附剂具有亲水性的负电荷表面,可与带有极性基团的霉菌毒素结合,如黄曲霉毒素;而ZEN和DON极性不强,不易被这类硅铝酸盐脱霉剂吸附。
对硅铝酸盐类表面基团或电荷进行改性或化学修饰后,形成新的基团和化学结构,从而改善其对其他霉菌毒素的吸附率。Lemke等在研究蒙脱石对ZEN的吸附试验中,发现蒙脱石经十六烷基吡啶或十六烷基三甲胺处理后,蒙脱石表面对水的亲和力下降,疏水性增强,对疏水性的ZEN具有更高的亲和力,极大提高对ZEN的吸附能力。Doll等研究硅铝酸盐经化学修饰后,在体外环境可对ZEN进行吸附。总而言之,硅铝酸盐类对黄曲霉毒素吸附性能良好,经过适当的改性或化学修饰,其吸附霉菌毒素能力更加广泛。但这类脱霉剂始终存在的缺点是对维生素和矿物质存在非选择性吸附。
3.3生物多糖类
生物多糖脱霉剂是指微生物细胞壁多糖或从微生物中提取出的多糖。目前常见的生物多糖脱霉剂有酵母、酵母细胞壁、葡甘露聚糖等。研究表明,酵母可降低AFB1对动物的毒害作用,灭活酵母无明显解毒作用,而对ZEN具有更强的吸附能力。酵母和酵母细胞壁均可作为霉菌毒素脱毒剂使用。而酵母细胞壁对毒素的吸附能力强于酵母细胞,这表明酵母细胞壁的特殊结构对霉菌毒素产生吸附力。酵母细胞壁有多糖、蛋白质,通过氢键、离子键和疏水作用对霉菌毒素产生吸附力,减少毒素在肠道吸收。从酵母细胞壁中提取的酯化葡甘露聚糖对AFB1、OTA和T-2毒素具有较高吸附能力。葡聚糖分子结构呈螺旋状,可与多种霉菌毒素形成特异的互补结构,与霉菌毒素紧密结合,防止被肠道吸收,最终排出体外。Aravind等在日粮中添加0.5%酯化葡聚糖,可以有效降低AFB1、OTA、ZEN和T-2毒素的毒害作用。同时也有报道葡聚糖对FB1吸附能力不高。
3.4微生物类
微生物脱毒法是利用一些具有特殊功能的微生物或其代谢产生的酶来降解饲料中的霉菌毒素,通过微生物温和降解霉菌毒素,减少使用强酸、强碱脱毒而破坏饲料营养成分,微生物降解过程,不会带入有毒有害的化学物质,还能尽可能减少饲料营养物质损失。微生物类脱霉剂根据去除霉菌毒素机理,又分为吸附类微生物脱毒剂和降解类微生物脱霉剂。
有研究发现,鼠李糖乳杆菌ATCC53103和鼠李糖乳杆菌DSM-705对AFB1的吸附率达到80%,经乙醇、紫外线、超声或碱处理杀死乳酸菌-AFB1复合物中的菌体,都不影响复合物对AFB1的吸附能力。Miao等从瘤胃中分离出8株乳酸菌均具有吸附ZEN能力,但吸附能力不同。在乳酸菌-AFB1复合体的研究中,发现疏水作用在维持复合体结构中起主要作用,复合体中的AFB1化学结构无变化,毒性仍较强。但乳酸菌-AFB1复合体可阻碍动物机体吸收黄曲霉毒素,便于毒素排出体外。
Tang等从土壤中分离出一株能够降解ZEN的不动杆菌属不动杆菌SM04,并在大肠杆菌和酿酒酵母表达系统中表达分离得到降解ZEN的过氧化物酶。有研究从假密环菌(Armillariellatabescens)中分离出一种可以降解AFB1的脱毒酶,经过该酶的处理,样品中黄曲霉毒素含量明显减少,黄曲霉毒素荧光特征明显减弱,表明该酶通过破坏双呋喃环破坏AFB1的毒性。Fuchs等从牛瘤胃分离得到1株厌氧优杆菌属细菌,可在24~48h内转化DON和其他单端孢霉烯族毒素,减弱毒素毒力,这种降解机理是通过酶促降解环氧环而对DON脱毒的。目前商业化生产的DON微生物脱毒剂主要成分为牛瘤胃微生物BBSH797。
4脱霉剂的使用
当前应用的脱霉剂主要还是以吸附为主,生物多糖类和微生物类脱霉剂的研究也主要集中在酵母、酵母细胞壁、乳酸菌等菌体对霉菌毒素的吸附作用,对微生物降解脱霉剂的研究较少,这类商品化脱霉剂产品少,脱毒降解机理尚不明确,使用条件、产品菌数等均尚不明确。因此,微生物类降解脱霉剂还需要大量的试验来筛选菌种,研究可行的降解使用方法,运用于生产。
5小结
防止霉菌和霉菌毒素的危害最直接方法是防止谷物和饲料霉变,防止饲料原料生产前霉变,控制好饲料加工过程,特别是控制好饲料的水分和高温制粒的降温过程;控制好饲料的贮藏和运输,防止饲料因潮湿、高温、包装损坏、温差、雨淋等引起的霉变。为防止霉变,可在饲料添加《饲料添加剂目录》“第8部分:防腐剂、防霉剂和酸度调节剂”产品。为预防霉菌毒素危害,可适当添加具有脱霉功能同时列入《饲料原料目录》或《饲料添加剂目录》的脱霉剂,如蒙脱石、酵母细胞壁等。[王孝忠,赵明,熊同舟,余瑞瑶,龚志军,李祚丹]