微生物检测手段及注意事项

血球计数板是一种有特别结构刻度和厚度的厚玻璃片,玻片上有四条沟和两条嵴,中央有一短横沟和两个平台,两嵴的表比两平台的表面高0.1mm,每个平台上刻有不同规格的格网,中央0.1mm2面积上刻有400个小方格。通过油镜观察,统计一定大格内微生物的数量,即可算出1mL菌液中所含的菌体数。这种方法简便,直观,快捷,但只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子进行计数,并且所得结果是包括死细胞在内的总菌数。

2.2染色计数法

为了弥补一些微生物在油镜下不易观察计数,而直接用血球计数板法又无法区分死细胞和活细胞的不足,人们发明了染色计数法。借助不同的染料对菌体进行适当的染色,可以更方便的在显微镜下进行活菌计数。如酵母活细胞计数可用美蓝染色液,染色后在显微镜下观察,活细胞为无色,而死细胞为蓝色。

2.3比例计数法

将已知颗粒(如霉菌孢子或红细胞)浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合,在显微镜视野中数出各自的数目,即可得未知菌液的细胞浓度。这种计数方法比较粗放。并且需要配制已知颗粒浓度的悬液做标准。

2.4液体稀释法

对未知菌样做连续十倍系列稀释,根据估计数,从最适宜的三个连续的10倍稀释液中各取5mL试样,接种1mL到3组共15只装培养液的试管中,经培养后记录每个稀释度出现生长的试管数,然后查最大或然数表MPN(MostProbableNumber)得出菌样的含菌数,根据样品稀释倍数计算出活菌含量。该法常用于食品中微生物的检测,例如饮用水和牛奶的微生物限量检查。

2.5平板菌落计数法

这是一种最常用的活菌计数法。将待测菌液进行梯度稀释,取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在凝固前均匀混合,或将菌液涂布于已凝固的固体培养基平板上。保温培养后,用平板上出现的菌落数乘以菌液稀释度,即可算出原菌液的含菌数。一般以直径9cm的平板上出现50~500个菌落为宜。但方法比较麻烦,操作者需有熟练的技术。平板菌落计数法不仅可以得出菌液中活菌的含菌数,而且同时将菌液中的'细菌进行了一次分离培养,获得了单克隆。

2.6试剂纸

在平板计数法的基础上,发展了小型商品化产品以供快速计数用。形式有小型厚滤纸片,琼脂片等。在滤纸和琼脂片中吸有合适的培养基,其中加入活性指示剂2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,无色)待蘸取测试菌液后置密封包装袋中培养。短期培养后在滤纸上出现一定密度的玫瑰色微小菌落与标准纸色板上图谱比较即可估算出样品的含菌量。试剂纸法计数快捷准确,相比而言避免了平板计数法的人为操作误差。

2.7膜过滤法

用特殊的滤膜过滤一定体积的含菌样品,经丫叮橙染色,在紫外显微镜下观察细胞的荧光,活细胞会发橙色荧光,而死细胞则发绿色荧光。

3.间接测定法

微生物的生长伴随着一系列生理指标发生变化,例如酸碱度,发酵液中的含氮量,含糖量,产气量等,与生长量相平行的生理指标很多,它们可作为生长测定的相对值。因此可利用生理指标等间接参数来测定生物量。

3.1测定含氮量

大多数细菌的含氮量为干重的12.5%,酵母为7.5%,霉菌为6.0%。根据含氮量×6.25,即可测定粗蛋白的含量。含氮量的测定方法有很多,如用硫酸,过氯酸,碘酸,磷酸等消化法和Dumas测N2气法。Dumas测N2气法是将样品与CuO混合,在CO2气流中加热后产生氮气,收集在呼吸计中,用KOH吸去CO2后即可测出N2的量。

3.2测定含碳量

将少量(干重0.2~2.0mg)生物材料混入1mL水或无机缓冲液中,用2mL2%的K2Cr2O7溶液在100℃下加热30分钟后冷却。加水稀释至5mL,在580nm的波长下读取吸光光度值,即可推算出生长量。需用试剂做空白对照,用标准样品做标准曲线。

3.3还原糖测定法

还原糖通常是指单糖或寡糖,可以被微生物直接利用,通过还原糖的测定可间接反映微生物的生长状况,常用于大规模工业发酵生产上微生物生长的常规监测。方法是,离心发酵液,取上清液,加入斐林试剂,沸水浴煮沸3分钟,取出加少许盐酸酸化,加入Na2S2O3临近终点时加入淀粉溶液,继续加Na2S2O3至终点,查表读出还原糖的含量。

3.4氨基氮的测定

离心发酵液,取上清液,加入甲基红和盐酸作指示剂,加入0.02mol/L的NaOH调色至颜色刚刚褪去,加入底物18%的中性甲醛,反应数刻,加入0.02mol/L的使之变色,根据NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根据培养液中氨基氮的含量,可间接反映微生物的生长状况。

3.5其他生理物质的测定

P,DNA,RNA,ATP,NAM(乙酰胞壁酸)等含量以及产酸,产气,产CO2(用标记葡萄糖做基质),耗氧,黏度,产热等指标,都可用于生长量的测定。也可以根据反应前后的基质浓度变化,最终产气量,微生物活性三方面的测定反映微生物的生长。如在BMP-2的发酵生产上,随时监测溶氧量的变化和酸碱度的变化,判断细菌的长势。

4.商业化快速微生物检测法

微生物的检测,其发展方向是快速,准确,简便,自动化,当前很多生物制品公司利用传统微生物检测原理,结合不同的检测方法,设计了形式各异的微生物检测仪器设备,正逐步广泛应用于医学微生物检测和科学研究领域。例如:

4.1试剂盒,培养基等手段

抗干扰培养基和微生物数量快速检测技术结合解决了传统微生物检测手段不能解决的难题,为建立一套完整的抗干扰微生物检测系统奠定了坚实的基础。如:抗干扰微生物培养基,新型生化鉴定管,微生物计数卡,环境质量检测试剂盒等,可方便的用于多项检测。

4.2借助新型先进仪器

BACTOMETER全自动各类总菌数及快速细菌检测系统可以数小时内获得监测结果,样本颜色及光学特征都不影响读数,对酵母和霉菌检测同样高度敏感原理是利用电阻抗法(ImpedanceTechnology)将待测样本与培养基置于反应试剂盒内,底部有一对不锈钢电极,测定因微生物生长而产生阻抗改变。如微生物生长时可将培养基中的大分子营养物经代谢转变为活跃小分子,电阻抗法可测试这种微弱变化,从而比传统平板法更快速监测微生物的存在及数量。测定项目包括总生菌数,酵母菌,大肠杆菌群,霉菌,乳酸菌,嗜热菌,革兰氏阴性菌,金黄色葡萄球菌等。

微生物OD值是反映菌体生长状态的一个指标,OD是OpticalDensity(光密度)的缩写,表示被检测物吸收掉的光密度。通常400~700nm都是微生物测定的范围,需要紫外分光光度计测最大吸收波长。用得最多的是:505nm测菌丝菌体、560nm测酵母、600nm测细菌。用测OD方法画微生物生长曲线时,同一株菌的起始培养浓度可以准备多管(根据检测点的需要,如需检测10个点,就准备10管),然后每个点取一管出来测OD值就行了。

一般测菌体密度的OD的波长范围是580nm-660nm,如枯草芽孢杆菌用600nm,已经属于可见光区(200nm~400nm为紫外光区,400nm~800nm为可见光区)。空白如用水做,需要离心洗涤菌体;空白如用不接种的培养基做就不需要洗涤,但是不接种的培养基要和接种的同时培养以求条件一致,最后注意一般OD值在控制在0.1~0.4最好,在这个区内的值就可靠,如果OD大于1.0,一般要稀释后再测,因为OD太大,分光光度计的灵敏度就会显著降低。

一般都测吸光值,而且最好是整个实验过程中,保持发酵液或菌体的稀释倍数一致,吸光值与稀释倍数不一定成正比,可保证整个实验点有可比性。且取值的时候要连续读数,重复3次的数最好。

另,用分光光度计测微生物的OD值为什么要把波长设为600nm

这个波长其实只是针对浊度,而分光光度计在600nm处对浊度的反应比较灵敏。测吸收峰的实际意义并不大,比如LB摇瓶培养过夜的大肠杆菌,其实在400多纳米处的吸收最大,但那很可能是培养液的吸收峰。

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