抗体生物素标记操作方法（具体操作步骤和方法含数据）
一般每个抗体可以标记3-5个生物素，标记时，生物素与抗体的比率受抗体浓度影响，对于10mg/ml的抗体溶液来说，生物素应超过蛋白12倍（摩尔数），对于2mg/ml的抗体溶液应超过20倍，生物素也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。
蛋白样品不得含有叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其他任何有自由氨基的添加物。
一、试剂和器材：
1、标记反应溶液：0.1MpH7.2PBS（0.15Msodiumchloride）
NaCl8.77g；Na2HPO4·12H2O32.3g；NaH2PO4·2H2O4.5g；加双蒸水900mL左右，用HCl/NaOH调pH至7.2，最后定容为1000mL
2、10mMNHS-dPEG4-Biotin配方：称取0.56mgNHS-dPEG4-Biotin（分子量为587），溶解于95μl超纯水中，临用前配置，不可储存，立刻使用。NHS-PEG4-Biotin容易潮解，开瓶前平衡至室温。也可以配置200nmol/L储备液：20mgNHS-dPEG4-Biotin溶解于170μlDMSO中，-20℃稳定几个月。
由于NHS-PEG4-Biotin昂贵，而且使用量少，不能保存，配制时，直接将NHS-PEG4-Biotin放入1.5mlEP管中，以实际称量的NHS-PEG4-Biotin按比率加入超纯水。
3、超滤管
⑴、Millipore超滤管[0.5ml10KD]:截留分子量10KD，残留体积200μl，蛋白回收率95%，7500×g（允许的最大离心力14000×g）离心10min。
⑵、Millipore超滤管[0.5ml50KD]:截留分子量50KD，残留体积80μl，蛋白回收率94%，7500×g（允许的最大离心力14000×g）离心5min。
⑶、AmiconUltra-0.5ml离心超滤管（Millipore），效果更好，典型的最终浓缩物体积：5-15ul。
二、抗体超滤处理
标记前需要应用截留分子量为50kDa的超滤柱对抗体进行标记前纯化处理(如果不是抗体，一定要按蛋白分子量来确定超滤柱截留分子量)，以除去蛋白样品中可能含有的叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其他任何有自由氨基的添加物，防止干扰标记反应。
具体操作步骤：
1、于超滤柱中加入200μl标记反应溶液，加入500ug单克隆抗体，混匀。
2、4℃，6000rpm，离心2min。弃滤液。
3、于超滤柱中加入100μl标记反应溶液，混匀。4℃，Max14000×g，2min。
4、重复步骤26到7次。
5、混匀超滤柱中的残留的液体，室温静置1min。
6、将超滤柱反转倒置于一新的超滤管中，4℃，1000×g，2min，收集滤液。
7、取50μlPBS于超滤柱中混匀，静置1min。
8、倒置超滤柱，4℃，6000rpm，2min。收集滤液，与步骤6的滤液合并，4℃放置备用。用标记反应溶液调节抗体浓度到2mg/ml（0.25ml）。
三、生物素标记抗体
1、计算抗体标记需要生物素用量。
抗体浓度2mg/ml时的简要计算：
1mLof2mg/mLIgG(150,000MW)需要26μLof10mMNHS-PEG4-Biotin
具体计算方式见附录一（标记生物素计算）
2、超滤后的滤液加入NHS-PEG4-Biotin溶液，室温反应1h。
3、葡聚糖凝胶分离纯化(去除游离生物素)：
四、葡聚糖凝胶分离纯化标记抗体操作步骤：
（一）、试剂：
1、纯化柱处理液:100mmol/LNa0H;
2、纯化柱平衡液:50mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.4)，每升含0.5gNaN3，8gNaCl;
3、样品洗脱液:同纯化柱平衡液;
4、标记抗体保护液（50×）:10ml0.01MpH7.2PBS中加入0.5gBSA，0.2gNaN3。
（二）、凝胶过滤：
方法见“凝胶过滤法纯化微量标记蛋白”
五、标记抗体的长期保存方法
将“标记抗体保护液（50×）”加入到标记抗体溶液中，使BSA终浓度为0.1%，4℃或-20℃保存。
六、数据记录：
抗体浓度：mg/ml加入抗体体积：μl
标记前抗体体积：μl加入NHS-PEG4-Biotin体积：μl
纯化柱规格：cm×cm凝胶体积：ml
加入标记抗体体积：μl
所有洗脱溶液1ml/管收集，到核酸蛋白检测仪显示出峰后，改为0.5ml/管收集，并记录数据：
管号
1
2
3
4
洗脱液体积
A280
5
6
7
8
9
10
11
12
附录：
一、标记生物素计算：
1、不同抗体浓度时，抗体与Sulfo-NHS-Biotin的比率：
Sulfo-NHS-BiotinMW：589
Sulfo-NHS-Biotin：抗体
抗体浓度10-12mg/ml时
抗体浓度4-7mg/ml时
16
抗体浓度1-3mg/ml时
20
抗体浓度0.5mg/ml时
50
2、10mmol/LSulfo-NHS-Biotin配方：
Sulfo-NHS-Biotin（mg)
PBS（μl)
Sulfo-NHS-Biotin（mg/μl)
0.56
95.1
0.00589
3、标记生物素计算加入体积计算：
计算公式
抗体浓度
2mg/ml时*
抗体浓度（mg/ml）
4.5
抗体加入量（ml)
0.11
抗体加入量（mg)
抗体浓度×抗体加入量
0.495
抗体的毫摩尔数（其他蛋白注意分子量）
抗体加入量/1500000
0.0000033
需要的活化Biotin量（mmol）
抗体的毫摩尔数×20
0.000066
活化Biotin量（mg）
Sulfo-NHS-Biotin量
（毫摩尔）×589
0.038874
需要10mmol/L活化Biotin体积（μl）
/活化Biotin浓度（mg/μl)
6.6
西安瑞禧生物可以提供的定制材料包括有：
dUTP-biotin
Biotin-Ubiquitin
生物素修饰的纳米银探针
生物素化的壳聚糖Bio-CS
星形七臂官能化聚己内酯(CDSPCABCL)
生物素修饰的Pluronic普朗尼克
生物素修饰二茂铁Biotin-Fc
生物素AP-tag标签的FOXM1真核表达载体
Biotin-PEG-PLLA-PLL
聚乙二醇-聚乳酸-二丙烯酸酯(PPA)共聚物
Mpeg-b-PCL-b-PPEEA聚乙二醇-聚已内酯-聚（氨乙基乙撑磷酸酯）
PLGA-PPEEA聚（氨乙基乙撑磷酸酯）-聚乳酸-羟基乙酸共聚物
PTMC-PEG-PTMC
生物素修饰的冬凌草甲素脂质体
叶酸/生物素双配体修饰的壳聚糖材料
FA-CS-g-PSBMA叶酸-壳聚糖-磺酸甜菜碱
乳糖修饰壳聚糖
乳糖修饰去甲斑蝥素(Lac-NCTD)
去甲斑蝥素壳聚糖纳米粒(NCTD-CS-NPs)
Biotin生物素偶联乳糖
半乳糖化壳聚糖接枝聚乙烯亚胺galactosylatedchitosan-g-PEI