章霞，徐志进*，柳敏海，李伟业，殷小龙
(浙江省舟山市水产研究所，浙江舟山316000)
关键词:滤料；生物挂膜；微生物多样性；水处理
生物滤料设聚乙烯环(PE)、聚苯乙烯泡沫滤珠(EPS)和电气石球组(T)，每组用PVC桶组装成各3套简易的循环水系统，上部为40L的滤料桶(直径25cm，高81.6cm)，其中装有20L滤料，下部为蓄水桶(直径100cm，高70cm)，盛放水体400L，通过水泵(流量2600L/h)实现下进水上出水循环，其中滤料与水体体积的比为1∶20。滤料图和水处理装置如图1、图2所示。
图1不同滤料Fig.1Differentfiltermaterialsusedintheexperiment
图2试验运行示意图Fig.2Operationschematicdiagraminthetrial
1.2.2挂膜滤料电镜观察取挂膜好的滤料进行叔丁醇脱水固定、真空冷冻机干燥，喷金后采用场发射扫描电子显微镜(日本Hitachis4800型)观察PE的侧切面及EPS、电气石球表面。
1.2.3挂膜成功后水体和滤料表面微生物多样性检测
(1)水中微生物取样。挂膜成功后，从每个桶各取水样2L，经0.22μm滤膜过滤，每组混合为1个样本，样本分别记为聚乙烯环水体(PEw)、泡沫滤珠水体(EPSw)和电气石球水体(Tw)。
(2)滤料表面微生物取样。挂膜成功后，从每个桶取约50mL待检测生物膜填料，用PBS缓冲液(0.1mol/L)清洗3遍去除生物膜表面附着杂质，再将填料置于50mL离心管中，加入25mLPBS缓冲液(0.1mol/L)和适量550℃下灼烧2h后的细砂(粒径<420μm)，盖好盖后将离心管在涡旋振荡器中旋转振荡5min(务必使细砂与填料达到充分接触的状态)，此过程中细砂与填料表面的碰撞与摩擦可以刮下填料细微结构部分的生物膜，略沉淀，用0.22μm滤膜过滤并取出填料，每组混合为1个样本。样本名称分别记为聚乙烯环(PE)、泡沫滤珠(EPS)、电气石球(T)。
(3)DNA提取及扩增测序分析。采用DNeasyPowerSoilKit(50)(MoBio)提取DNA，并采用引物进行16SrDNAV4高可变区的PCR扩增。本试验中采用带GC夹细菌通用引物341F(5′CCTACGGGAGGCAGCAG3′)和534R(5′ATTACCGCGGCTGCTGG3′)进行细菌基因组DNA的扩增，GC-clamp序列为CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGGG，扩增片段为细菌16SrDNA的V3～V4可变区。PCR反应体系(50μL)为：10×LAPCRbuffer(mg2+plus)5μL，10mmol/LdNTP4μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL，50ng/μL模板DNA2.0μL，灭菌去离子水36.5μL。采用降落PCR模式touchdown-PCR，反应程序为：94℃下预变性5min，94℃下循环变性30s，65℃下退火复性30s，72℃下延伸90s，每个退火温度降0.5℃，共进行20个循环，在此退火温度下再进行15个循环，最终在72℃下延伸5min，用10g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
(4)测序数据。由IlluminaMiseq测序先获得原始双端测序数据，再经过去杂、拼接、嵌合体序列处理后获得较为优质的序列validtags，最后进行OTU分类、系统发育树、Alpha及Beta多样性等分析。
采用SPSS19.0软件对试验数据进行方差分析和差异显著性检验，显著性水平设为0.05。
图33个水处理组中氨氮含量的变化Fig.3Changesinammonia-nitrogenconcentrationin3watertreatmentgroups
图43个水处理组中亚硝酸盐含量的变化Fig.4Changesinnitriteconcentrationin3watertreatmentgroups
在系统运行48d后，随机取PE、EPS及T组的生物填料进行电镜扫描(图5)，结果显示：PE在2万倍显微镜下观察，表面有球菌和杆菌附着；EPS在3万倍显微镜下观察，表面有大量球菌；电气石球在1万倍显微镜下观察，表面有大量球菌和杆状细菌。可见，3种材料均实现了生物挂膜。
注：M为球状细菌；R为杆状细菌Note：M，micrococcus;R，rod-shapedbacteria图53种滤料成熟挂膜后的电镜图Fig.5Electronicmicroscopicimageof3kindsoffiltermaterialsaftermaturemembranehanging
2.3.1不同滤料组的氨氮去除能力从表1可见：3组滤料中氨氮去除率在前6h略有降低，在6～12h时，氨氮有所升高，在12h后，氨氮去除率开始下降；在18h时EPS组氨氮的去除率显著高于其他两组(P<0.05)；T组在30h时氨氮去除率达90.80%，PE组在42h时氨氮去除率达90.75%，EPS组在54h时氨氮去除率达92.23%。可见，T组的去除效率高于PE组和EPS组；在54～66h时，T组、PE组的氨氮去除率显著高于EPS、T组(P<0.05)，84～96h时，各组间的氨氮去除率均无显著性差异(P>0.05)。
Tab.1Ammonianitrogenremovalrateofthreekindsoffiltermaterialsatdifferenttime%
注：同行中标有不同字母者表示组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)，下同
Note：Themeanswithdifferentletterswithinthesamelinearesignificantdifferencesatthe0.05probabilitylevel,andthemeanswiththesameletterswithinthesamelinearenotsignificantdifferences,etsequentia
Tab.2Nitritenitrogenremovalrateofthreekindsoffiltermaterialsatdifferenttime
%
2.4.1不同滤料组细菌丰度及多样性分析从表3可见：3组循环系统水体中和滤料表面的微生物原始序列和有效序列差异不大，通过比较3组样品的Chao指数、Shannon指数、Simpson指数发现，PE组水体中微生物丰富度和群落多样性均高于其他两组，EPS组滤料表面的微生物丰富度高于其他两组，而PE组滤料表面的微生物群落多样性则高于其他两组。
表33组水循环系统中细菌丰度情况Tab.3Bacterialabundancein3groupsofwatercirculationsystems
类别type样品sampleID原始序列cleantag有效序列validtag有效序列占比/%percentofvalidtag操作分类单元数量outcountChao指数Chaoindex香农指数Shannonindex辛普森指数Simpsonindex水体waterPEw394373312083.98308314.673.770.68EPSw396913505588.31194244.482.240.49Tw400113392584.78169175.182.630.68滤料filtermediumPE582043781364.97785782.88.480.99EPS473263429672.4710281027.46.560.90T613754848779.00721673.95.190.88
2.4.2样本的Alpha多样性指数分析和物种间相似性分析从RankAbundance曲线可以看出样品所含物种的丰富程度和均匀程度，曲线在横轴上的长度越宽表示物种组成越丰富，而在纵轴上跨度越小、曲线越平坦表示物种组成均匀程度越高。从图6可见，水体中PEw的微生物物种组成相比EPSw和Tw较为丰富和均匀，而滤料EPS表面的微生物物种组成相比PE和T滤料较为丰富和均匀。根据OTU注释结果，绘制3个样本的微生物物种间相似性的双层聚类图(Heatmap)，包括样本间聚类关系树和物种OTU丰度相似性树。从图7可以看出，无论水体中还是滤料表面的微生物组成均为EPS组和T组的相似性较高。
图63组滤料运行系统细菌的丰富程度比较Fig.6Comparisonoftheabundanceofbacteriain3filtermediumoperationsystems
2.4.33组滤料运行系统水体细菌在门、属分类层面的分布规律3组循环水处理中水体和滤料表面微生物在门分类层面的分布规律如表4所示，无论水中还是滤料表面，PE组的细菌群落结构多样性较EPS组和T组更为丰富，且丰富度排列前5的细菌门类大致相同，分别为变形菌门、厚壁菌门、
表43组循环系统水中及滤料表面细菌(门)的群落组成相对百分比
Tab.4Relativepercentagesofbacterialcommunitycomposition(phylum)inthecirculatingwaterandfiltermaterialsin3groups%
门phylum水体water滤料filtermediumPEwEPSwTwPEEPST变形菌门Proteobacteria78.5497.3697.0319.1871.4381.96厚壁菌门Firmicutes13.630.800.0154.217.864.83拟杆菌门Bacteroidetes6.591.272.5314.6013.343.38放线菌门Actinobacteria0.450.210.186.241.650.45硝化螺旋菌门Nitrospirae0.400.040.060.063.998.80TM60.030.220.0400.110.07Gracilibacteria0.030.070.140.0600.01无壁菌门Tenericutes0.14001.070.220.01梭杆菌门Fusobacteria0.08000.140.040酸杆菌门Acidobacteria0.030.0100.130.130.07蓝藻细菌门Cyanobacteria00.020.010.190.010Cloacimonetes0.0300———芽单胞菌门Gemmatimo-nadetes0.03002.400.410.07
拟杆菌门、放线菌门、硝化螺旋菌门，各组中细菌丰富度排列顺序和种类略有差异。PEw按照菌类丰富度排列前5的分别为变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、硝化螺旋菌门；EPSw中分别为变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、TM6、放线菌门；Tw中分别为变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、Gracilibacteria、硝化螺旋菌门。其中，水体中EPSw和Tw的变形菌门占比均高于PEw，而厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和硝化螺旋菌门占比相较PEw则少；水体中PEw的微生物中存在厚壁菌门、梭杆菌门、芽单胞菌门和Cloacimonetes，而EPSw、Tw中则未检测到。滤料中，PE中按照菌类丰富度排列前5的分别为厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、芽单胞菌门；EPS中分别为变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、硝化螺旋菌门、放线菌门；T中分别为变形菌门、硝化螺旋菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门。其中，PE中厚壁菌门、放线菌门占比较其他两组高；T中硝化螺旋菌门占比高于EPS和PE；EPS、T中变形菌门远高于PE。
注：A为滤料上的微生物；B为水体中的微生物
Note：A，microorganismsonfiltermaterial;B，microorganismsinwater
图73组微生物DNA样本的物种丰度聚类图Fig.7SpeciesabundanceclusteringofmicrobialDNAsamplesin3groupsofwatersystem
从表5可见：水体中细菌丰富度属类差异也较大，其中，PEw中按照丰富度排列前5的分别为远洋杆菌属、拟杆菌属、乳酸杆菌属、油螺旋菌属、OM43_clade；EPSw中分别为远洋杆菌属、OM43_clade、油螺旋菌属、NS5_marine_group、醋杆菌属；Tw中分别为远洋杆菌属、油螺旋菌属、OM43_clade、中温黄杆菌属和贝塔变形菌属。
表53组循环系统水中细菌(属)的群落组成相对百分比
Tab.5Relativepercentagesofbacterialcommunitycomposition(genus)in3groupsofcirculatingwatersystem%
属genusPEwEPSwTw远洋杆菌属CandidatusPelagibacter56.3970.7546.72油螺旋菌属Neptunomonas1.603.0731.20OM43_clade1.343.181.83拟杆菌属Bacteroides4.730.010.00乳酸杆菌属Lactobacillus3.290.330.01中温黄杆菌属Mesoflavibacter0.020.021.65贝塔变形菌属CandidatusNitrotoga0.310.410.88魏斯氏菌属Weissella1.190.100.00劳特氏菌属Blautia1.140.010.01醋杆菌属Acetobacter0.530.470.00NS5_marine_group0.140.590.27假交替单胞菌属Pseudoalteromonas0.040.090.75粪便杆菌属Faecalibacterium0.680.010.00假螺菌属Pseudospirillum0.130.350.09亚硝化单胞菌属Nitrosomonas0.250.120.15
从表6可见：滤料中，PE表面生物膜按照丰富度排列前5的分别为Symbiobacterium、Mobilitalea、尿素芽孢杆菌属、瘤胃梭菌属、拟杆菌属；EPS表面排列前5的分别为贝塔变形菌属、亚硝化单胞菌属、硝化螺旋菌属、Owenweeksia、拟杆菌属；T表面排列前5的分别为贝塔变形菌属、亚硝化单胞菌属、硝化螺旋菌属、拟杆菌属、粪杆菌属。
表63组循环系统滤料表面细菌(属)的群落组成相对百分比
Tab.6Relativepercentagesofbacterialcommunitycomposition(genus)in3filtermedia%
属genusPEEPST贝塔变形菌属CandidatusNitrotoga0.0031.0230.49亚硝化单胞菌属Nitrosomonas0.004.9218.86硝化螺旋菌属Nitrospira0.063.998.80Symbiobacterium5.680.520.02Mobilitalea5.310.620.02拟杆菌属Bacteroides2.611.831.06尿素芽孢杆菌属Ureibacillus4.230.550.01瘤胃梭菌属Ruminiclostridium2.740.270.03棘刺杆菌属Sphingobacterium2.090.120.01芽孢杆菌属Bacillus1.570.230.01Owenweeksia01.900.05鲁杰氏菌属Ruegeria0.071.230.31粪杆菌属Faecalibacterium0.250.320.79热微菌属Tepidimicrobium1.280.150假黄色单胞菌属Pseudoxanthomonas1.170.220.01
此外本研究中还发现，水体中和滤料表面中的优势菌属在3组中各不相同，聚乙烯环组水体拟杆菌属、乳酸杆菌属、粪便杆菌属、亚硝化单胞菌属占比均高于其他两组，而滤料中聚乙烯环组贝塔变形菌属、亚硝化单胞菌属均未被检测到，硝化螺旋菌属也明显低于聚苯乙烯泡沫滤珠组和电气石球组，推测聚乙烯环组水处理优势菌主要集中的水体中，而聚苯乙烯泡沫滤珠组和电气石球组水处理优势菌主要集中在滤料表面，更深入和科学的研究还有待继续。
(2)在水处理效果试验中，48h内，氨氮、亚硝酸盐去除效率依次为电气石球>聚乙烯环>聚苯乙烯泡沫滤珠。
(3)微生物多样性分析显示，电气石球组的水体中变形杆菌门明显高于聚乙烯环水体，滤料中变形杆菌门和硝化螺旋菌门显著高于聚乙烯环和聚苯乙烯泡沫滤珠。
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ZHANGXia,XUZhijin*,LIUMinhai,LIWeiye,YINXiaolong
(ZhoushanFisheriesResearchInstituteofZhejiangProvince,Zhoushan316000,China)
Keywords：filtermaterial;biofilm;microbialdiversity;watertreatment
DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2019-167
收稿日期：2019-07-25
基金项目：浙江省重点研发计划项目(2019C02048)；浙江省基础公益研究计划项目(LGN19C190001)；2017省农林渔业经营与管理体系建设专项(浙财农[2016]120号,舟财农[2017]78号)
作者简介：章霞(1989—)，女，工程师。E-mail：yufan414515@163.com
通信作者：徐志进(1979—)，男，高级工程师。E-mail：33853377@qq.com