木质素及其降解物是造纸废水的重要成分,占总CODCr的50%左右.由于木质素具有复杂的苯环结构,因此,传统生物处理对其降解耗时长、去除率低.目前,已经筛选到的降解木质素的细菌大多是好氧细菌,主要集中在放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)等,部分能在厌氧情况下生长.纯培养功能菌则对菌种培养条件的要求较高、重复性较差,降解过程非常缓慢.
基于此,本研究以溶解态木质素模拟废水为研究对象,考察活性污泥反应器、电极生物膜反应器及电极生物膜-活性污泥反应器中木质素废水的处理效能,探究不同电流强度对悬浮污泥生理特性的影响,并利用磷脂脂肪酸(PLFA)及16SrRNA基因高通量测序研究不同电流强度下微生物细胞膜磷脂组成和群落结构的差异,以期为电场强化技术处理木质素废水的工程应用提供理论依据.
2材料与方法
2.1反应器的启动与运行
2.2实验方法
R1为不加电流的对照反应器,R2、R3反应器两电极分别与直流稳压电源的正、负极连接且以10mA的弱电流进行驯化,具体运行方式如下：1~41d(第1阶段),R2、R3外加电流10mA;42~53d(第2阶段),外加电流20mA;54~65d(第3阶段),外加电流30mA;66~77d(第4阶段),外加电流40mA;78~89d(第5阶段),外加电流50mA;90~101d(第6阶段),外加电流60mA.同时在每个阶段对R1、R3反应器中悬浮污泥进行微生物活菌比、三磷酸腺苷(ATP)、比耗氧速率(SOUR)、酶活、PLFA、微生物群落结构等的测定.
2.3分析项目和方法2.3.1常规指标测定
污泥浓度(MLSS)、COD、NH3-N、TN的测定均参照国标法.微生物活菌比采用LIVE/DEAD?BacteriaViabilityKit(BacLightTM,MolecuLarProbes,InvitrogenL7012)染色法测定,结果用活菌百分比表示.ATP采用荧光素-荧光素酶法测定.比耗氧速率(SOUR)的测定参照Hao等的方法.
2.3.2木质素磺酸钠浓度测定
紫外分光光度法(UV)是用来测定木质素及其衍生物的常用方法,木质素及木材提取物中的酚羟基离子在280nm处存在一个相对稳定的吸收峰.因此,在制浆造纸行业中该吸收峰通常被用来指示木质素及大部分木材提取物的浓度.通过实验室分析,本实验中所用的木质素磺酸钠溶液在紫外276nm(UV276)处存在一个稳定的吸收峰.当木质素浓度低于0.2g·L-1时,其浓度与吸光度呈现出明显的线性关系.
2.3.3木质素过氧化物酶(LiP)测定
采用黄丹莲等报道的方法,取0.6mL黎芦醇溶液(10mmol·L-1)、1.2mL酒石酸缓冲液(250mmol·L-1,pH=3.0)与1.2mL粗酶液混匀,在30℃下,于反应液中加入60μLH2O2溶液(20mmol·L-1)启动酶促反应,并在310nm波长下测定30min前后反应液吸光度的变化.一个酶活力单位(U)定义为每分钟氧化黎芦醇产生1μmol黎芦醛所需的酶量.
2.3.4细胞膜磷脂脂肪酸分析
PLFA的提取方法根据Balser等报道的方法进行了适当修正,通过对活性污泥样品的提取、分离及皂化、甲基化、萃取等一系列前处理后,将提取出的PLFA采用安捷伦7800A气相色谱进行测定.气相色谱各参数由MIDISherlock程序设置调用.
2.3.5微生物群落结构检测
采用16SrRNA基因高通量测序进行检测.污泥样品DNA的提取及PCR扩增采用周莉娜等报道的方法.经琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物后,采用纯化试剂盒(Cycle-PureKit,OMEGABio-tek,Inc.)纯化后送至江苏中宜金大分析检测有限公司进行Miseq测序.
2.4数据统计与分析
常规水质指标的数据处理采用Origin9.2软件,微生物活菌比结果采用ImageJ软件进行分析,Miseq数据经Sickle及Mothur降噪后,通过RDP分类处理.采用SPSSstatistics22.0.0分析软件进行单因素方差分析(AVONA),用于检验不同物种对于各项环境因素是否具有显著性差异,当p<0.05时,认为具有显著性差异.PCA与RDA分析采用Canoco软件.
3结果与讨论3.1电流强度对反应器运行效能的影响
反应器运行情况如图1所示.图1a反映了反应器进、出水COD情况,进水COD为(530.0±7.9)mg·L-1,第1~41d(第1阶段)时,R1、R3的平均COD去除率分别为73.71%±2.39%和78.88%±1.75%(p<0.05).第1d时,R2反应器的COD去除率仅为25.16%,此时由于反应器中无接种污泥,因此,COD的去除仅为10mA电流的作用.第5d开始,R2反应器的COD去除率升到65.16%,此时观察到R2反应器的极板上已有少量微生物附着.第42~53d(第2阶段)与54~65d(第3阶段)时,电流由20mA升高到30mA,与R1相比,R2、R3的COD去除率分别提高了2%(p<0.05)和7%(p<0.05),出水COD分别为(139.72±5.75)和(112.47±6.06)mg·L-1;第66d电流再次升高后,R2与R3的COD去除率开始下降,最终与R1的COD去除率基本一致.
综上,30mA电流条件下,在污泥负荷为0.12kg·kg-1·d-1时,电极生物膜-活性污泥反应器(R3)木质素去除率最高,为活性污泥反应器(R1)的2.01倍(p<0.05);20~40mA时电极生物膜反应器(R2)总氮去除率最大,为71.96%±5.79%.
3.2电流强度对活性污泥微生物活性的影响
微生物活菌比可以用来判定活性污泥在受到电流胁迫下细胞膜的损伤程度(图2a).R3各电流下的活性污泥活菌比(70.80%±2.67%、73.92%±3.15%、72.80%±2.70%、74.32%±2.28%、70.08%±3.89%、74.95%±0.37%)相比于R1(66.85%±2.12%)有所上升,统计学分析表明,不同电流强度下并无显著性差异(p>0.05).这表明在10~60mA的外加电流下,反应器里面的大部分细菌的细胞膜都很完整,未出现大量细菌的凋亡.
在直流电场的处理过程中,ATP含量可以作为评价微生物代谢活性的生物指标(.R1、R3反应器的ATP含量变化情况如图2b所示,稳定期R1(0mA)活性污泥ATP含量为(5.74±0.14)μg·g-1(以MLSS计,下同)(第31~101d平均值);10mA时,R3活性污泥的ATP含量最高,为(7.81±0.04)μg·g-1;其次是20mA与30mA时,分别为(5.84±0.01)和(5.58±0.18)μg·g-1;而40、50、60mA时ATP含量分别为(3.50±0.19)、(4.02±0.34)和(3.77±0.1)μg·g-1,显著低于R1(p<0.05).说明30mA以内不会影响微生物代谢活性,而过高的电流强度则会抑制微生物代谢活性.Wang等的研究表明,利用微生物电解池(MEC)处理高硫酸盐废水时,与控制组相比,0.5mA时ATP含量增加,2.5mA和3.5mA时,ATP含量急剧下降,与本研究结论类似.
比耗氧速率(SOUR)可作为表征污泥活性的重要指标,从微生物呼吸速率角度反映活性污泥生理状态和基质代谢状况.R1、R3反应器的SOUR变化情况如图2b所示,稳定期R1(0mA)活性污泥SOUR为(1.26±0.05)mg·g-1·min-1(以每gMLSS每分钟消耗的O2量(mg)计,下同)(第31~101d平均值),10mA时,R3活性污泥的SOUR升高,为(1.38±0.01)mg·g-1·min-1,20mA与30mA时SOUR继续升高,分别为(1.75±0.02)和(1.85±0.06)mg·g-1·min-1,40、50、60mA时R3活性污泥SOUR降低,分别为(1.31±0.01)、(1.2±0.03)、(1.33±0.04)mg·g-1·min-1.由此可见,不同电流下,活性污泥SOUR变化趋势与木质素去除率基本一致.
综上,在悬浮污泥中,随着外加电流的增加(0~60mA),LiP酶活、ATP、SOUR等活性指标均呈先升后降趋势,而活菌比则不受影响(p>0.05).
3.3电流强度对活性污泥微生物细胞膜磷脂脂肪酸的影响
不同电流强度下各组样品的PLFA组成情况如表1所示,其中,在各组样品中PLFA组成成分含量均低于0.5%的因其含量过低而不具体列出,磷脂脂肪酸的碳链长度主要分布在C11~C20之间,共检测到20种类型的磷脂脂肪酸,其中,占主要比重的磷脂脂肪酸为C15:0ANTEISO、C16:00和C18:00.R1(0mA)活性污泥C15:0ANTEISO含量为23.12%.总体而言,高电流下C15:0ANTEISO的含量(16.52%(40mA)、24.06%(50mA)、13.86%(60mA))较低电流下含量低(24.55%(10mA)、26.77%(20mA)、25.62%(30mA)).由于C15:0ANTEISO相比于其它支链脂肪酸具有较低的相变温度(23℃,因此,微生物可以更好地维持其流动性.另外,60mA条件下检测出的磷脂脂肪酸的碳链长度变长(C19、C20).Ma等的研究表明,当反应器达到稳定运行阶段时,长链脂肪酸的含量增加(C原子数>18).
表1不同电流下活性污泥整体PLFA情况
据Fang等报道,外界环境条件影响微生物细胞膜不饱和脂肪酸的含量.图3反映了不同电流下活性污泥微生物细胞膜磷脂的组成情况.如图3a所示(其中,SFA、AFA、IFA、UFA、OFA分别代表饱和、反式异构、异构、不饱和和其他脂肪酸),R1活性污泥不饱和脂肪酸的含量为2.22%.高电流(40~60mA)下不饱和脂肪酸的含量(2.21%~4.17%)较低电流(10~30mA)下不饱和脂肪酸的含量高(0.37%~1.78%).相反,低电流(10~30mA)下支链脂肪酸的含量(38.66%~41.53%)高于高电流(40~60mA)下支链脂肪酸的含量(24.56%~39.95%).据报道,支链脂肪酸含量的降低可能是一种防止细胞膜流动过快的防御机制,从而实现最优生长.Nenninger等的研究表明,主要长链脂肪与主要短链脂肪酸的比值增大,代表着细胞膜磷脂流动性降低.如图3b所示,本研究中,主要长链脂肪酸与主要短链脂肪酸分别为C18和C15,总体而言,高电流下C18/C15值(0.68~1.45)较低电流(0.66~0.69)高,因此,推测高电流下细胞膜磷脂流动性可能降低.
图4为不同电流强度下活性污泥PLFA组成主成分分析结果.PC1和PC2分别代表了63.9%和26.9%的差异,结果主要分布在4个区域.主成分分析显示,S1、S2、S3与空白之间的差异度较小,其微生物细胞膜PLFA组成具有一定的相似性,且以C14~C16支链脂肪酸为主;另外3个区域分别代表了S4、S5、S6样品,其与空白组差异度相对较大.S4与其它样品之间差异度最大,其PLFA组成以C16和C18饱和脂肪酸为主;S5的PLFA组成以C15饱和脂肪酸与C17支链脂肪酸为主;S6的PLFA组成则以C18~C20为主.可见随着电流的升高,检测出的磷脂脂肪酸的碳链长度变长.
3.4电流强度对微生物群落结构的影响
通过16SrRNA基因高通量测序技术对活性污泥的微生物群落结构进行分析,结果如图5所示.由图5可知,R1(0mA)活性污泥以变形菌门(Proteobacteria,42.24%)为主,其次为放线菌门(Actinobacteria,27.24%).另外,相对丰度低于10%的门类微生物包括拟杆菌门(Bacteroidetes,9.22%)、酸杆菌门(Acidobacteria,3.90%)、TM7(3.78%)、硝化螺菌(Nitrospira,2.85%)等14个门.高电流下放线菌门的相对丰度(20.74%(40mA)、21.13%(50mA)、23.13%(60mA))低于低电流下的相对丰度(30.25%(10mA)、39.39%(20mA)、33.79%(30mA)),而变形菌门的相对丰度在高电流下增加(51.93%(40mA)、51.21%(50mA)、52.51%(60mA)).据报道,能够降解木质素的好氧细菌种类较多,目前主要集中在放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)等.本研究的结果表明,低电流能够促进放线菌门丰度的增加,而变形菌门则具有更高的电流耐受力.变形菌门是石油精炼、丙烯酸类高聚物、制药、乳清粉加工、钢铁和宠物食品加工等污水处理厂中的优势菌门.
阴极和阳极微生物群落结构在门水平上差异较大.R2阴极微生物以变形菌门(Proteobacteria,84.32%)为主,除变形菌门占主体外,其次是放线菌门(Actinobacteria,11.89%)和拟杆菌门(Bacteroidetes,2.86%).而阳极微生物则以放线菌门(Actinobacteria,57.20%)为主,其次是变形菌门(Proteobacteria,30.81%)、拟杆菌门(Bacteroidetes,3.29%)和TM7(1.09%).R3阴极微生物以变形菌门(Proteobacteria,90.55%)为主,其次是放线菌门(Actinobacteria,8.18%).阳极微生物以放线菌门(Actinobacteria,54.90%)为主,其次是变形菌门(Proteobacteria,29.83%)、拟杆菌门(Bacteroidetes,2.99%)和酸杆菌门(Acidobacteria,1.20%).可见R2、R3反应器电极微生物在门水平上相似度较高.阴极微生物群落结构均较单一,且以变形菌门为主,而阳极则以放线菌门为主.目前,在微生物燃料电池研究中发现的大部分具有细胞外电子传递功能的微生物都属于变形菌门.已有研究表明,由于阴极反应将造成电极表层的氧气浓度降低甚至变成厌氧区,因此,会造成电极表面持菌量下降,这可能是阴极表面微生物群落结构单一的原因.
4结论
1)30mA电流条件下,电极生物膜-活性污泥反应器(R3)木质素去除率最高,为活性污泥反应器(R1)的2.01倍(p<0.05).
2)外加电流会影响活性污泥微生物的细胞膜磷脂组成,高电流(40~60mA)与低电流(10~30mA)相比,微生物细胞膜磷脂流动性可能降低.