本发明具体涉及一种犬博卡病毒的通用型PCR检测引物、试剂盒和检测方法。
背景技术：
博卡病毒（Bocavirus）是细小病毒科细小病毒亚科的一个属，为单股线状无囊膜的DNA病毒，基因组大小在5.4kb左右。20世纪60年代初首次在牛群发现。近年来，随着病毒宏基因组及高通量测序技术的快速发展，人博卡病毒、猪博卡病毒、犬博卡病毒、黑猩猩博卡病毒、海狮博卡病毒等被前后被发现。然而，在遗传学上，它们之间的遗传进化关系较远，基因组同源性低于60%。此外，也未发现博卡病毒存在跨种传播的事实。
技术实现要素：
本发明的目的在于运用分子生物学、生物信息学等方法进行引物设计、序列比对及反应体系优化，组建犬博卡病毒通用性检测试剂盒以及检测方法。该试剂盒为犬博卡病毒诊断提供了一种快速检测方法，填补了国内犬博卡病毒诊断方法的空白，为犬博卡病毒的诊断、调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。
本发明所采取的技术方案是：
一种犬博卡病毒的通用型PCR检测引物，其核苷酸序列如下所示：
CBoV-F:AARAGRAARCTYTATTTTGC（SEQIDNO:1）；
CBoV-R:TGCCAGTCTTGWGGHGARAA（SEQIDNO:2）。
一种犬博卡病毒的通用型PCR检测试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物。
一种犬博卡病毒的通用型PCR检测方法，包括下列步骤：
1)从样品中提取病毒核酸；
2)以核酸为模板，用上述引物对CBoV-F和CBoV-R进行PCR扩增反应获得扩增产物；
3)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察结果，确定病毒类型。
优选的，步骤2）中PCR扩增反应体系为：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，ddH2O8.5μl，DNA模板3μL，引物CBoV-F0.5μL，引物CBoV-R0.5μL，总体积为25μL。
优选的，步骤2）中PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共计40个循环；72℃终延伸10min。
本发明的有益效果是：
本发明的犬博卡病毒的通用型PCR检测引物、试剂盒以及检测方法，不仅仅用于宠物犬的疾病诊断和检测，还可以应用于野生犬、肉用犬、实验犬等的检测。
本发明所制备的犬博卡病毒通用型PCR检测试剂盒，具有特异性强、敏感性高、省时省力等优点。
本发明PCR检测方法为犬博卡病毒的诊断提供一种快速检测方法，填补国内犬博卡病毒诊断方法的空白，为犬博卡病毒的诊断、调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。
附图说明
图1是犬博卡病毒通用型PCR检测试剂盒特异性试验结果；泳道M：DNAMarker2000；泳道1：犬瘟热病毒；泳道2：犬细小病毒；泳道3：犬传染性肝炎病毒；泳道4：犬副流感病毒；泳道5：猫瘟热病毒；泳道6：犬博卡病毒。
图2是犬博卡病毒通用型PCR检测试剂盒敏感性试验结果；其中泳道M：DNAMarker2000；泳道1-11分别为阳性质粒的100倍、101倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍、1010倍倍比稀释结果。
具体实施方式
材料和方法：
犬博卡病毒阳性重组质粒，犬细小病毒（CPV）、犬瘟热病毒（CDV）、犬传染性肝炎病毒（ICHV）、犬副流感病毒（CPIV），猫瘟热病毒（FDV）细胞分离上清液等由广东省农业科学院动物卫生研究所制备保存。此外，犬博卡病毒阳性毒株由香港大学刘嘉佩教授馈赠。
主要试剂：
DNA提取试剂盒、PCR试剂购自北京天根公司，DNAMarker2000购自Takara公司。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1PCR引物设计
根据犬博卡病毒1型、2型和3型基因序列设计出扩增犬博卡病毒保守基因序列的引物对CBoV-F和CBoV-R，其碱基序列如下所示。
实施例2病毒DNA提取及PCR分析
1）DNA的提取
按照DNA提取试剂盒说明书进行病毒DNA提取。
2）犬博卡病毒PCR检测试剂盒
以犬博卡病毒（犬博卡病毒2型）DNA为PCR的模板，建立犬博卡病毒PCR检测试剂盒。PCR反应体系为：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，ddH2O8.5μl，DNA模板3μL，引物CBoV-F0.5μL，引物CBoV-R0.5μL，总体积为25μL。
PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共计40个循环；72℃终延伸10min。
结果观察：取10μLPCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察结果。如果出现长度为400bp左右的目标条带，则判定为犬博卡病毒。
实施例3特异性试验
以实施例2中优化好的通用型PCR试剂盒涉及的反应体系及条件，对犬博卡病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒、犬副流感病毒，猫瘟热病毒等进行PCR扩增，来检测该试剂盒的特异性。结果见图1。
图1凝胶电泳结果显示，只有犬博卡病毒阳性重组质粒出现预期大小（400bp左右）的扩增目的条带，而犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒、犬副流感病毒，猫瘟热病毒等未呈现条带，表明该试剂盒具有较好的特异性。
实施例4敏感性试验
选取犬博卡病毒阳性重组质粒为模板（浓度为480.62ng/μL)，进行倍比稀释（分别为100倍、101倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍、1010倍稀释），来测定该方法的敏感性。结果见图2。
图2结果显示：泳道6的结果为最高的稀释倍数105，即优化后的试剂盒敏感性为4.8062pg/μL。
实施例5临床样品检测
从广州周边地区采集临床犬粪便样本425份，进行PCR检测。
经检测，425份临床样本中有1份犬博卡病毒阳性样本，进一步经核酸测序，确定该样本感染犬博卡病毒2型（CBoV2）。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCELISTING
<110>广东省农业科学院动物卫生研究所
<120>一种犬博卡病毒的通用型PCR检测引物、试剂盒和检测方法