本发明涉及一种重组狂犬病病毒疫苗株及其制备方法，属于动物疫苗技术领域。
背景技术：
狂犬病是由狂犬病病毒(rabiesvirus,rabv)感染宿主中枢神经系统造成的一种烈性人畜共患传染病。宿主一旦发病，死亡率接近100％，目前尚无有效的治疗手段。近些年，我国平均每年约有3000人左右死于狂犬病，位居传染病死亡人数前三位，多数是由于被动物咬伤或者抓伤而被感染。数据显示，70％以上犬的免疫覆盖率可以有效控制人间狂犬病，因此，动物的免疫预防成为遏制人类狂犬病最为有效的措施。当前用于动物狂犬病免疫的疫苗主要为安全的灭活疫苗，但价格昂贵，并需多次免疫才能获得良好的保护，阻碍了其在我国的广泛应用。并且此类疫苗对于流浪动物及野生动物的免疫接种很难实现。而在我国，街头的流浪狗、猫等动物为当前狂犬病的主要传染源，将流浪动物进行有效的免疫是狂犬病防控的关键。因此，当前狂犬病毒研究的主要目标之一是发展低毒、可简化免疫程序及长期有效的狂犬病疫苗。
ox40l是重要的协同刺激分子，参与机体免疫应答和多种疾病调控策略的重要环节。目前，国内外鲜有ox40l在疫苗诱导的免疫反应中调控滤泡内生发中心免疫途径的研究报道。通过细胞因子增强体液免疫反应对高效的狂犬病疫苗的研发具有重大意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一株重组狂犬病病毒疫苗株，该病毒疫苗可以促进狂犬病毒免疫原性，诱导滤泡性t辅助细胞、生发中心b细胞和浆细胞的产生，增强机体的体液免疫反应。
本发明所述组狂犬病病毒疫苗株以之前报道的狂犬病疫苗株lbnse为母本，将鼠源ox40l基因插入到lbnse毒株基因组中，通过反向遗传操作技术拯救出能够表达鼠ox40l基因的重组狂犬病毒lbnse-ox40l，该病毒株具有较高的病毒滴度，安全性高，并且在免疫后7天能迅速产生显著高水平的中和抗体，并维持机体体液免疫反应长达56天。
本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：
本发明所述重组狂犬病病毒疫苗株，以致弱疫苗sad-b19为母体毒株，将所述毒株的g蛋白上194位的天冬氨酸(aat)突变为丝氨酸(tcc)，将333位的精氨酸(aga)突变为谷氨酸(gaa)，在致弱疫苗sad-b19的基因组的g基因和l基因之间插入核苷酸序列如seqidno:1所示的鼠源ox40l基因。
本发明的另一目的在于提供所述重组狂犬病病毒疫苗株的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)以致弱疫苗sad-b19为母体毒株，将所述毒株的g蛋白上194位的天冬氨酸(aat)突变为丝氨酸(tcc)，将333位的精氨酸(aga)突变为谷氨酸(gaa)，极大减弱了病毒的致病性。
(2)将致弱疫苗sad-b19毒株基因组中g和l基因之间的假基因敲除，并嵌入两个酶切位点bsiwi和nhei，作为插入外源基因的位点，用反转录pcr扩增得到鼠源ox40l基因，将扩增的鼠ox40l基因经测序验证正确后插入到lbnse毒株基因组的g基因和l基因之间，构建出表达鼠ox40l基因的重组病毒，重组病毒命名为lbnse-ox40l，基因序列如seqidno:2所示。
本发明中的鼠ox40l基因的克隆是通过狂犬病毒感染小鼠，提取大脑组织rna，然后用反转录pcr扩增得到鼠源ox40l基因；将扩增的鼠ox40l基因经测序验证正确后插入到lbnse毒株基因组的g基因和l基因之间，构建出表达鼠ox40l基因的感染性克隆lbnse-ox40l。
将lbnse-ox40l感染性克隆与表达狂犬病毒n、p、g和l四个蛋白的辅助质粒共同转染bsr细胞后，并将转染细胞7天后所获得的上清感染bsr细胞，以抗rabvn蛋白的荧光抗体检测是否拯救成功；提取病毒感染细胞的rna，通过rt-pcr检测确定所扩增的片段为ox40l基因。
本发明中的重组病毒lbnse-ox40l在bsr细胞及na细胞上的生长曲线与lbnse病毒相似，表明外源基因鼠ox40l的插入并没有显著影响到病毒的生长和增殖；另外，重组病毒lbnse-ox40l在na和bsr细胞上的滴度均可以达到108ffu/ml，满足多种免疫途径滴度的要求。
以亲本病毒组lbnse为对照，将重组病毒lbnse-ox40l脑内途径感染免疫功能完全小鼠(6周龄icr小鼠)和免疫功能不完全小鼠(3-5日龄icr乳鼠)，在观察的21天内，成年小鼠未表现出任何发病症状，并且体重未有显著变化；lbnse-ox40l所感染的3-5日龄乳鼠的存活率稍高于亲本病毒组lbnse，表明该重组病毒安全性高。
本发明中重组病毒lbnse-ox40l具有良好的复制性，安全性，并且通过鼠ox40l基因的插入增强了免疫原性，能迅速产生显著高水平的中和抗体，维持机体的长久体液免疫反应，显著优于lbnse病毒(欧洲用于野生动物免疫的疫苗株)，因此，重组病毒lbnse-ox40l可以作为狂犬病疫苗的候选株。
本发明的有益效果：
本发明公开一种高效的重组狂犬病病毒疫苗株，它是以sad-b19为母本毒株，将所述母本毒株g蛋白上194位的天冬氨酸突变为丝氨酸、333位的精氨酸突变为谷氨酸，并且在所述母本毒株的基因组g基因和l基因之间被插入鼠ox40l基因，该重组病毒具有良好的复制性，安全性，通过插入鼠ox40l基因增强了狂犬病毒的免疫原性，促进机体的体液免疫反应，迅速升高并维持长久的中和抗体水平，是一种优良的狂犬病疫苗候选株。
附图说明
图1是在狂犬病毒疫苗株lbnse基因组中插入鼠源ox40l基因的构建示意图。
图2是拯救出的重组狂犬病病毒lbnse-ox40l的免疫荧光实验检测结果。
图3是鼠ox40l基因插入到狂犬病病毒的基因组鉴定电泳图。
图4是重组病毒lbnse-ox40l在不同细胞系上的生长曲线示意图。
图5是各重组病毒不同moi感染bsr细胞后上清中ox40l的表达情况。
图6是各重组病毒细胞活性比较情况。
图7是重组病毒lbnse-ox40l对成年小鼠脑内攻毒后的体重变化曲线。
图8是重组病毒lbnse-ox40l对乳鼠脑内攻毒后的存活率。
图9是重组病毒lbnse-ox40l在小鼠体内诱导滤泡性t辅助细胞产生的试验结果。
图10是重组病毒lbnse-ox40l在小鼠体内诱导生发中心b细胞产生的试验结果。
图11是重组病毒lbnse-ox40l在小鼠体内诱导浆细胞产生的试验结果。
图12是重组病毒lbnse-ox40l免疫后的抗体滴度检测结果。a：中和抗体滴度；b：igg抗体亚类水平。
图13是免疫21天后以狂犬病毒强毒株cvs-24脑内攻毒检测重组病毒lbnse-ox40l的保护率结果。
具体实施方式
实施例1
重组病毒lbnse-ox40l的设计、拯救、鉴定及免疫效力初步评价
1材料和方法
1.1材料
1.1.1病毒
lbnse毒株由华中农业大学农业微生物国家重点实验室提供，该病毒的具体信息和构建方法可参考有关文献(weny,wangh,wuh,yangf,trippra,etal.(2011)rabiesvirusexpressingdendriticcell-activatingmoleculesenhancestheinnateandadaptiveimmuneresponsetovaccination.jvirol85:1634-1.)。
1.1.2质粒
用于拯救lbnse毒株的感染性克隆plbnse的构建策略及具体方法可参考有关文献(weny,wangh,wuh,yangf,trippra,etal.(2011)rabiesvirusexpressingdendriticcell-activatingmoleculesenhancestheinnateandadaptiveimmuneresponsetovaccination.jvirol85:1634-1.)。
1.1.3细胞和单克隆抗体
1.1.4实验动物
6周龄的icr小鼠，6周龄的balb/c小鼠，购于湖北省疾病预防控制中心。
1.1.5主要试剂
质粒提取试剂盒、superfect转染试剂盒均购于qiagen公司，各种限制性内切酶购于newenglandbiolab，amvreversetranscriptasexl及primerstarhspcr购自takara公司。
1.2引物的设计与合成
用于扩增鼠ox40l基因及rt-pcr检测鼠ox40l基因的引物见表1，由昆明擎科公司合成。
表1
注：鼠ox40l扩增/检测上游引物序列中的下划线部分为bsiwi限制性内切酶位点，下游引物序列划线部分为nhei限制性内切酶位点。
1.3狂犬病毒感染小鼠，提取大脑组织rna及鼠ox40l基因的扩增
①以狂犬病毒b2c肌肉途径感染balb/c小鼠。
②感染7天后，收集鼠脑组织，提取rna，用amvreversetranscriptasexl进行反转录后用takaraprimerstarhspcr扩增鼠源ox40l。
1.4重组病毒lbnse-ox40l的拯救
转染前一天将bsr细胞接种于六孔板，使细胞于第二天使用时达到80％的覆盖度，按照转染试剂superfect(qiagen公司)的产品说明说进行操作，将2ug的全长感染性克隆，0.5ugn辅助质粒，0.25ugp辅助质粒，0.15ugg辅助质粒以及0.1ugl辅助质粒共同转染bsr细胞，转染后的细胞放入37℃培养箱，co2浓度为5％，孵育4小时，然后将上清倒掉，用含10％fbs的dmem培养基洗一次，再加入新鲜培养基培养4天，把上清液转移到bsr单层细胞上，在34℃含5％co2的培养箱培养3天，收集上清，-80℃分装保存。
1.5拯救病毒的鉴定
1.5.1免疫荧光检测
将拯救的病毒与bsr细胞于96孔细胞板共培养48小时后，将上清弃掉，用预冷的80％丙酮于4℃固定30分钟，然后用pbs洗2遍，将异硫氰酸荧光素标记的狂犬病毒核蛋白单克隆抗体进行1:70稀释，每孔加入50ul，放入37℃孵育1小时后用pbs洗三遍，在荧光显微镜进行观察。
1.5.2反转录(rt)pcr检测鼠ox40l
将拯救的病毒与bsr细胞共培养48小时后，将细胞刮下提取总rna，rt-pcr进行检测。
1.6病毒滴定
在96孔细胞培养板中加入90μldmem培养基；取10μl冰浴的病毒样品10倍系列稀释(每个样品有四个重复)，然后每孔加入终浓度为1×104个/mlbsr细胞稀释液；轻混匀，放入37℃5％的co2培养箱中48小时；弃去病毒培养基，每孔100μlpbs洗3次，加入每孔50μl冷丙酮常温固定15分钟，每孔100μl的pbs洗3次；加入1:150稀释的异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,fitc)荧光标记的抗狂犬病毒(rabiesvirus,rabv)的n蛋白的抗体每孔50μl，抗体染色后，通过荧光显微镜观察并记录抗原阳性区域(antigen-positivefoci)。根据reed-muench法进行病毒毒力的计算并记录为ffu/ml(fluorescentfocusunitspermilliliter)。
1.7重组病毒lbnse-ox40l在bsr和na细胞上的生长特性
1.7.2细胞接种于96孔板中(1×104细胞/孔)，将lbnse-ox40l和亲本毒株lbnse分别以moi＝0.01感染细胞；以细胞活性检测试剂盒，检测重组病毒对感染细胞是否有副作用。
1.8动物实验
1.8.1重组病毒lbnse-ox40l致病性实验
以icr小鼠为模型，选取106ffu/ml的体积内病毒所能达到的最高滴度，将重组病毒lbnse-ox40l和母本毒lbnse以及dmem对6周龄雌性小鼠进行脑内途径感染，攻毒部位为右侧眼角与耳屏连线中间处，观察记录2w内小鼠的临床症状、死亡及体重变化；将lbnse和lbnse-ox40l以100ffu(体积为10μl)脑内途径感染5日龄乳鼠；记录实验小鼠3周内存活率，检测重组病毒对免疫不完全小鼠的致病性影响。比较lbnse-ox40l和lbnse的致病性差异。
1.8.2重组病毒lbnse-ox40l中和抗体水平实验
将6-8周龄的icr小鼠，每组12只，分别用1ml无菌注射器将含有1×106ffu的lbnse毒株和1×106ffu的重组病毒株lbnse-ox40l进行肌肉途径免疫，并分别于免疫后每周进行采血测定中和抗体水平，连续采集9周。
1.8.3特异性抗体亚类的检测
将蔗糖密度梯度离心纯化后的lbnse使用抗原包被液稀释至蛋白质含量为500ng/孔，4℃过夜包被96孔elisa板，弃去未结合的蛋白，200μl/孔的pbst洗涤3次，每次5分钟；加入含5％脱脂奶粉的pbst，37℃封闭2小时，封闭结束后，200μl/孔的pbst洗涤3次，每次5分钟；使用pbst将血清按1:30稀释，100μl/孔，于37℃孵育2小时，孵育后用200μl/孔的pbst洗涤3次，每次5分钟；用5％脱脂奶粉-pbst将生物素标记的羊抗鼠igg、igg1、igg2a、igg2b、igg3和igm进行稀释，100μl/孔，37℃孵育45分钟，孵育后，200μl/孔的pbst洗涤3次，每次5分钟；加入100μl/孔tmb底物溶液，37℃孵育30分钟；加入50μl/孔的2mh2so4终止反应。于elisa检测仪上，450nm处，检测各孔od值。
1.8.4重组病毒lbnse-ox40l保护率实验
于免疫21天时以50ld50cvs-24脑内途径攻毒icr小鼠，观察21天，检测lbnse-ox40l的保护率。
2.实验结果
2.1感染性克隆lbnse-ox40l的构建及拯救病毒检测
lbnse毒株是在sad-b19的基础上在g基因194位和333位进行突变，并且将g和l基因之间的假基因敲除，加入两个酶切位点bsiwi和nhei。重组病毒lbnse-ox40l是在lbnse病毒的基础上，将鼠ox40l基因扩增并测序正确后插入到g基因和l基因之间(如图1所示)，利用反向遗传技术拯救病毒，拯救的病毒用免疫荧光实验进行检测，如图2所示，可以看到绿色的荧光灶，即为拯救出的重组狂犬病病毒lbnse-ox40l，而细胞阴性对照则观察不到荧光灶。另外，为了检测鼠ox40l基因是否已插入到拯救的病毒中，将拯救的病毒感染bsr细胞后，提前rna进行反转录pcr检测，上游引物设计在鼠ox40l基因插入的位点bsiwi上游，下游引物设计在另一插入位点nhei的下游，具体引物序列见表1；检测结果如图3所示，第1泳道为lbnse毒株可以扩增到225bp的目的条带，而第2泳道的lbnse-ox40l可以看到597bp的目的条带，将琼脂糖回收的597bp的片段进行测序，确定其为ox40l基因。
2.2病毒的体外生长特性
2.2.1多步生长曲线
为进一步鉴定重组病毒的体外表型特征，以低感染复数(moi＝0.01)分别在bsr细胞(图4a)和na细胞(图4b)上测定重组病毒的多步生长曲线。如图所示，亲本病毒lbnse和重组病毒lbnse-ox40l均在感染后第4天病毒滴度升至最高，通过显著性分析发现两重组病毒在两种细胞中5天内的滴度与亲本病毒无显著差异，这说明重组病毒的生长特性并不因外源基因ox40l的插入而受到影响。
2.2.2各重组病毒表达ox40l的情况
通过elisa试剂盒检测各重组病毒不同moi感染bsr细胞后上清中ox40l的表达情况(图5)。如图所示，lbnse-ox40l能够以剂量依赖的形式高表达ox40l，即随着感染复数的递增，而lbnse感染的细胞上清中未检测到ox40l的显著表达。
2.2.3ox40l的表达对感染细胞活性的影响
应用细胞毒性检测试剂盒对病毒感染后的bsr细胞进行活性检测(图6)。发现lbnse-ox40l所感染细胞的活性与亲本病毒无显著差异，说明ox40l的过表达对感染细胞没有副作用。
2.3重组病毒致病性情况检测
将重组病毒lbnse-ox40l、lbnse毒株以及dmem脑内注射6周龄的icr小鼠和5日龄icr乳鼠，观察3周，如图7所示，成年小鼠观察期间并未出现任何发病症状，体重未发生明显变化，说明重组病毒对成年小鼠无致病性，安全性高。如图8所示，lbnse-ox40l组的乳鼠的存活率稍高于lbnse。以上结果表明，lbnse-ox40l更具安全性。
2.4重组病毒诱导滤泡性t辅助细胞的产生
以免疫体积为100μl的1×106ffu的lbnse、lbnse-ox40l或dmem对6周龄的balb/c雌鼠进行双后肢肌肉免疫，并在免疫后7天和14天收集小鼠腹股沟淋巴结，制成单细胞悬液后，添加流式抗体染色后检测分析滤泡性t辅助细胞的数量。如图9所示，发现免疫后7天和14天均能诱导滤泡性t辅助细胞的产生，从而促进机体的体液免疫反应。
2.5重组病毒诱导生发中心b细胞的产生
以1×106ffu的lbnse、lbnse-ox40l或dmem以肌肉途径免疫balb/c小鼠，并于免疫后7d和14d用流式抗体对小鼠的腹股沟淋巴结中单个细胞进行生发中心b细胞群分析，确定生发中心b细胞的增殖变化；如图10所示，发现免疫后7天和14天能够诱导生发中心b细胞的产生，从而促进机体的体液免疫反应。
2.6重组病毒诱导浆细胞的产生
在以1×106ffu的lbnse-ox40l和lbnse后肢肌肉免疫小鼠后的7天及14天，我们用流式抗体分析小鼠的骨髓细胞中浆细胞亚群占所收集的骨髓细胞的比例。如图11所示，发现免疫后7天和14天，能诱导浆细胞的产生，从而促进机体的体液免疫反应。
2.7重组病毒肌肉免疫效果评价
2.7.1中和抗体和狂犬病毒特异性抗体亚类的水平
如图12b的狂犬病毒特异性抗体亚类的含量检测结果显示，与中和抗体滴度的趋势一致，lbnse-ox40l所免疫的小鼠能产生较高水平的特异性的igg、igg1、igg2a、igg2b、igg3和igm。
2.7.2过表达ox40l对狂犬病疫苗保护效力的影响
如图13所示，在免疫21天时以50ld50cvs-24脑内途径攻毒icr小鼠，lbnse-ox40l具有良好的保护率。
总之，本发明中的重组狂犬病病毒lbnse-ox40l安全性高，在免疫效果上，与欧洲用于野生动物免疫的疫苗株即实验中的母本株lbnse相比，lbnse-ox40l能够迅速诱导产生显著高的中和抗体水平，并长达56天。因此，本发明重组病毒lbnse-ox40l具备了作为疫苗株的安全低毒、长期有效的特点，可以作为狂犬病疫苗的候选株。
序列表
<110>大理大学
<120>一种重组狂犬病病毒疫苗株及其制备方法
<130>20200416
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>597
<212>dna
<213>鼠ox40l(rattus,ox40l)
<400>1
atggaaggggaaggggttcaacccctggatgagaatctggaaaacggatcaaggccaaga60
ttcaagtggaagaagacgctaaggctggtggtctctgggatcaagggagcagggatgctt120
ctgtgcttcatctatgtctgcctgcaactctcttcctctccggcaaaggaccctccaatc180
caaagactcagaggagcagttaccagatgtgaggatgggcaactattcatcagctcatac240
aagaatgagtatcaaactatggaggtgcagaacaattcggttgtcatcaagtgtgatggg300
ctttatatcatctacctgaagggctcctttttccaggaggtcaagattgaccttcatttc360
cgggaggatcataatcccatctctattccaatgctgaacgatggtcgaaggattgtcttc420
actgtggtggcctctttggctttcaaagataaagtttacctgactgtaaatgctcctgat480
actctctgcgaacacctccagataaatgatggggagctgattgttgtccagctaacgcct540
ggatactgtgctcctgaaggatcttaccacagcactgtgaaccaagtaccactgtga597
<211>12173
<213>重组狂犬病病毒疫苗(lbnse-ox40l)
acgcttaacaaccagatcaaagaaaaaacagacattgtcaattgcaaagcaaaaatgtaa60
cacccctacaatggatgccgacaagattgtattcaaagtcaataatcaggtggtctcttt120
gaagcctgagattatcgtggatcaatatgagtacaagtaccctgccatcaaagatttgaa180
aaagccctgtataaccctaggaaaggctcccgatttaaataaagcatacaagtcagtttt240
gtcaggcatgagcgccgccaaacttaatcctgacgatgtatgttcctatttggcagcggc300
aatgcagttttttgaggggacatgtccggaagactggaccagctatggaattgtgattgc360
acgaaaaggagataagatcaccccaggttctctggtggagataaaacgtactgatgtaga420
agggaattgggctctgacaggaggcatggaactgacaagagaccccactgtccctgagca480
tgcgtccttagtcggtcttctcttgagtctgtataggttgagcaaaatatccgggcaaaa540
cactggtaactataagacaaacattgcagacaggatagagcagatttttgagacagcccc600
ttttgttaaaatcgtggaacaccatactctaatgacaactcacaaaatgtgtgctaattg660
gagtactataccaaacttcagatttttggccggaacctatgacatgtttttctcccggat720
tgagcatctatattcagcaatcagagtgggcacagttgtcactgcttatgaagactgttc780
aggactggtatcatttactgggttcataaaacaaatcaatctcaccgctagagaggcaat840
actatatttcttccacaagaactttgaggaagagataagaagaatgtttgagccagggca900
ggagacagctgttcctcactcttatttcatccacttccgttcactaggcttgagtgggaa960
atctccttattcatcaaatgctgttggtcacgtgttcaatctcattcactttgtaggatg1020
ctatatgggtcaagtcagatccctaaatgcaacggttattgctgcatgtgctcctcatga1080
aatgtctgttctagggggctatctgggagaggaattcttcgggaaagggacatttgaaag1140
aagattcttcagagatgagaaagaacttcaagaatacgaggcggctgaactgacaaagac1200
tgacgtagcactggcagatgatggaactgtcaactctgacgacgaggactacttttcagg1260
tgaaaccagaagtccggaggctgtttatactcgaatcatgatgaatggaggtcgactaaa1320
gagatctcacatacggagatatgtctcagtcagttccaatcatcaagcccgtccaaactc1380
attcgccgagtttctaaacaagacatattcgagtgactcataagaagttgaataacaaaa1440
tgccggaaatctacggattgtgtatatccatcatgaaaaaaactaacacccctcctttcg1500
aaccatcccaaacatgagcaagatctttgtcaatcctagtgctattagagccggtctggc1560
cgatcttgagatggctgaagaaactgttgatctgatcaatagaaatatcgaagacaatca1620
ggctcatctccaaggggaacccatagaggtggacaatctccctgaggatatggggcgact1680
tcacctggatgatggaaaatcgcccaaccatggtgagatagccaaggtgggagaaggcaa1740
gtatcgagaggactttcagatggatgaaggagaggatcctagcttcctgttccagtcata1800
cctggaaaatgttggagtccaaatagtcagacaaatgaggtcaggagagagatttctcaa1860
gatatggtcacagaccgtagaagagattatatcctatgtcgcggtcaactttcccaaccc1920
tccaggaaagtcttcagaggataaatcaacccagactactggccgagagctcaagaagga1980
gacaacacccactccttctcagagagaaagccaatcatcgaaagccaggatggcggctca2040
aattgcttctggccctccagcccttgaatggtcggctaccaatgaagaggatgatctatc2100
agtggaggctgagatcgctcaccagattgcagaaagtttctccaaaaaatataagtttcc2160
ctctcgatcctcagggatactcttgtataattttgagcaattgaaaatgaaccttgatga2220
tatagttaaagaggcaaaaaatgtaccaggtgtgacccgtttagcccatgacgggtccaa2280
actccccctaagatgtgtactgggatgggtcgctttggccaactctaagaaattccagtt2340
gttagtcgaatccgacaagctgagtaaaatcatgcaagatgacttgaatcgctatacatc2400
ttgctaaccgaacctctcccctcagtccctctagacaataaaatccgagatgtcccaaag2460
tcaacatgaaaaaaacaggcaacaccactgataaaatgaacctcctacgtaagatagtga2520
aaaaccgcagggacgaggacactcaaaaatcctctcccgcgtcagcccctctggatgacg2580
atgacttgtggcttccaccccctgaatacgtcccgctgaaagaacttacaggcaagaaga2640
acatgaggaacttttgtatcaacggaagggttaaagtgtgtagcccgaatggttactcgt2700
tcaggatcctgcggcacattctgaaatcattcgacgagatatattctgggaatcatagga2760
tgatcgggttagtcaaagtggttattggactggctttgtcaggatctccagtccctgagg2820
gcctgaactgggtatacaaattgaggagaacctttatcttccagtgggctgattccaggg2880
gccctcttgaaggggaggagttggaatactctcaggagatcacttgggatgatgatactg2940
agttcgtcggattgcaaataagagtgattgcaaaacagtgtcatatccagggcagagtct3000
ggtgtatcaacatgaacccgagagcatgtcaactatggtctgacatgtctcttcagacac3060
aaaggtccgaagaggacaaagattcctctctgcttctagaataatcagattatatcccgc3120
aaatttatcacttgtttacctctggaggagagaacatatgggctcaactccaacccttgg3180
gagcaatataacaaaaaacatgttatggtgccattaaaccgctgcatttcatcaaagtca3240
agttgattacctttacattttgatcctcttggatgtgaaaaaaactattaacatccctca3300
aaagactcaaggaaagatggttcctcaggctctcctgtttgtaccccttctggtttttcc3360
attgtgttttgggaaattccctatttacacgataccagacaagcttggtccctggagtcc3420
gattgacatacatcacctcagctgcccaaacaatttggtagtggaggacgaaggatgcac3480
caacctgtcagggttctcctacatggaacttaaagttggatacatcttagccataaaagt3540
gaacgggttcacttgcacaggcgttgtgacggaggctgaaacctacactaacttcgttgg3600
ttatgtcacaaccacgttcaaaagaaagcatttccgcccaacaccagatgcatgtagagc3660
cgcgtacaactggaagatggccggtgaccccagatatgaagagtctctacacaatccgta3720
ccctgactaccgctggcttcgaactgtaaaaaccaccaaggagtctctcgttatcatatc3780
tccaagtgtggcagatttggacccatatgacagatcccttcactcgagggtcttccctag3840
cgggaagtgctcaggagtagcggtgtcttctacctactgctccactaaccacgattacac3900
catttggatgcccgagaatccgagactagggatgtcttgtgacatttttacctccagtag3960
agggaagagagcatccaaagggagtgagacttgcggctttgtagatgaaagaggcctata4020
taagtctttaaaaggagcatgcaaactcaagttatgtggagttctaggacttagacttat4080
ggatggaacatgggtctcgatgcaaacatcaaatgaaaccaaatggtgccctcccgataa4140
gttggtgaacctgcacgactttcgctcagacgaaattgagcaccttgttgtagaggagtt4200
ggtcaggaagagagaggagtgtctggatgcactagagtccatcatgacaaccaagtcagt4260
gagtttcagacgtctcagtcatttaagaaaacttgtccctgggtttggaaaagcatatac4320
catattcaacaagaccttgatggaagccgatgctcactacaagtcagtcgaaacttggaa4380
tgagatcctcccttcaaaagggtgtttaagagttggggggaggtgtcatcctcatgtgaa4440
cggggtgtttttcaatggtataatattaggacctgacggcaatgtcttaatcccagagat4500
gcaatcatccctcctccagcaacatatggagttgttggaatcctcggttatcccccttgt4560
gcaccccctggcagacccgtctaccgttttcaaggacggtgacgaggctgaggattttgt4620
tgaagttcaccttcccgatgtgcacaatcaggtctcaggagttgacttgggtctcccgaa4680
ctgggggaagtatgtattactgagtgcaggggccctgactgccttgatgttgataatttt4740
cctgatgacatgttgtagaagagtcaatcgatcagaacctacgcaacacaatctcagagg4800
gacagggagggaggtgtcagtcactccccaaagcgggaagatcatatcttcatgggaatc4860
acacaagagtgggggtgagaccagactgtaaggactggccgtcctttcaacgatccaagt4920
ccatgaaaaaaactaacacccctcccgtacgaacatggaaggggaaggggttcaacccct4980
ggatgagaatctggaaaacggatcaaggccaagattcaagtggaagaagacgctaaggct5040
ggtggtctctgggatcaagggagcagggatgcttctgtgcttcatctatgtctgcctgca5100
actctcttcctctccggcaaaggaccctccaatccaaagactcagaggagcagttaccag5160
atgtgaggatgggcaactattcatcagctcatacaagaatgagtatcaaactatggaggt5220
gcagaacaattcggttgtcatcaagtgtgatgggctttatatcatctacctgaagggctc5280
ctttttccaggaggtcaagattgaccttcatttccgggaggatcataatcccatctctat5340
tccaatgctgaacgatggtcgaaggattgtcttcactgtggtggcctctttggctttcaa5400
agataaagtttacctgactgtaaatgctcctgatactctctgcgaacacctccagataaa5460
tgatggggagctgattgttgtccagctaacgcctggatactgtgctcctgaaggatctta5520
ccacagcactgtgaaccaagtaccactgtgactagctagcttataaagtgctgggtcatc5580
taagcttttcagtcgagaaaaaaacattagatcagaagaacaactggcaacacttctcaa5640
cctgagacttacttcaagatgctcgatcctggagaggtctatgatgaccctattgaccca5700
atcgagttagaggctgaacccagaggaacccccattgtccccaacatcttgaggaactct5760
gactacaatctcaactctcctttgatagaagatcctgctagactaatgttagaatggtta5820
aaaacagggaatagaccttatcggatgactctaacagacaattgctccaggtctttcaga5880
gttttgaaagattatttcaagaaggtagatttgggttctctcaaggtgggcggaatggct5940
gcacagtcaatgatttctctctggttatatggtgcccactctgaatccaacaggagccgg6000
agatgtataacagacttggcccatttctattccaagtcgtcccccatagagaagctgttg6060
aatctcacgctaggaaatagagggctgagaatccccccagagggagtgttaagttgcctt6120
gagagggttgattatgataatgcatttggaaggtatcttgccaacacgtattcctcttac6180
ttgttcttccatgtaatcaccttatacatgaacgccctagactgggatgaagaaaagacc6240
atcctagcattatggaaagatttaacctcagtggacatcgggaaggacttggtaaagttc6300
aaagaccaaatatggggactgctgatcgtgacaaaggactttgtttactcccaaagttcc6360
aattgtctttttgacagaaactacacacttatgctaaaagatcttttcttgtctcgcttc6420
aactccttaatggtcttgctctctcccccagagccccgatactcagatgacttgatatct6480
caactatgccagctgtacattgctggggatcaagtcttgtctatgtgtggaaactccggc6540
tatgaagtcatcaaaatattggagccatatgtcgtgaatagtttagtccagagagcagaa6600
aagtttaggcctctcattcattccttgggagactttcctgtatttataaaagacaaggta6660
agtcaacttgaagagacgttcggtccctgtgcaagaaggttctttagggctctggatcaa6720
ttcgacaacatacatgacttggtttttgtgtttggctgttacaggcattgggggcaccca6780
tatatagattatcgaaagggtctgtcaaaactatatgatcaggttcaccttaaaaaaatg6840
atagataagtcctaccaggagtgcttagcaagcgacctagccaggaggatccttagatgg6900
ggttttgataagtactccaagtggtatctggattcaagattcctagcccgagaccacccc6960
ttgactccttatatcaaaacccaaacatggccacccaaacatattgtagacttggtgggg7020
gatacatggcacaagctcccgatcacgcagatctttgagattcctgaatcaatggatccg7080
tcagaaatattggatgacaaatcacattctttcaccagaacgagactagcttcttggctg7140
tcagaaaaccgaggggggcctgttcctagcgaaaaagttattatcacggccctgtctaag7200
ccgcctgtcaatccccgagagtttctgaggtctatagacctcggaggattgccagatgaa7260
gacttgataattggcctcaagccaaaggaacgggaattgaagattgaaggtcgattcttt7320
gctctaatgtcatggaatctaagattgtattttgtcatcactgaaaaactcttggccaac7380
tacatcttgccactttttgacgcgctgactatgacagacaacctgaacaaggtgtttaaa7440
aagctgatcgacagggtcaccgggcaagggcttttggactattcaagggtcacatatgca7500
tttcacctggactatgaaaagtggaacaaccatcaaagattagagtcaacagaggatgta7560
ttttctgtcctagatcaagtgtttggattgaagagagtgttttctagaacacacgagttt7620
tttcaaaaggcctggatctattattcagacagatcagacctcatcgggttacgggaggat7680
caaatatactgcttagatgcgtccaacggcccaacctgttggaatggccaggatggcggg7740
ctagaaggcttacggcagaagggctggagtctagtcagcttattgatgatagatagagaa7800
tctcaaatcaggaacacaagaaccaaaatactagctcaaggagacaaccaggttttatgt7860
ccgacatacatgttgtcgccagggctatctcaagaggggctcctctatgaattggagaga7920
atatcaaggaatgcactttcgatatacagagccgtcgaggaaggggcatctaagctaggg7980
ctgatcatcaagaaagaagagaccatgtgtagttatgacttcctcatctatggaaaaacc8040
cctttgtttagaggtaacatattggtgcctgagtccaaaagatgggccagagtctcttgc8100
gtctctaatgaccaaatagtcaacctcgccaatataatgtcgacagtgtccaccaatgcg8160
ctaacagtggcacaacactctcaatctttgatcaaaccgatgagggattttctgctcatg8220
tcagtacaggcagtctttcactacctgctatttagcccaatcttaaagggaagagtttac8280
aagattctgagcgctgaaggggagagctttctcctagccatgtcaaggataatctatcta8340
gatccttctttgggagggatatctggaatgtccctcggaagattccatatacgacagttc8400
tcagaccctgtctctgaagggttatccttctggagagagatctggttaagctcccaagag8460
tcctggattcacgcgttgtgtcaagaggctggaaacccagatcttggagagagaacactc8520
gagagcttcactcgccttctagaagatccgaccaccttaaatatcagaggaggggccagt8580
cctaccattctactcaaggatgcaatcagaaaggctttatatgacgaggtggacaaggtg8640
gaaaattcagagtttcgagaggcaatcctgttgtccaagacccatagagataattttata8700
ctcttcttaatatctgttgagcctctgtttcctcgatttctcagtgagctattcagttcg8760
tcttttttgggaatccccgagtcaatcattggattgatacaaaactcccgaacgataaga8820
aggcagtttagaaagagtctctcaaaaactttagaagaatccttctacaactcagagatc8880
cacgggattagtcggatgacccagacacctcagagggttgggggggtgtggccttgctct8940
tcagagagggcagatctacttagggagatctcttggggaagaaaagtggtaggcacgaca9000
gttcctcacccttctgagatgttgggattacttcccaagtcctctatttcttgcacttgt9060
ggagcaacaggaggaggcaatcctagagtttctgtatcagtactcccgtcctttgatcag9120
tcatttttttcacgaggccccctaaagggatacttgggctcgtccacctctatgtcgacc9180
cagctattccatgcatgggaaaaagtcactaatgttcatgtggtgaagagagctctatcg9240
ttaaaagaatctataaactggttcattactagagattccaacttggctcaagctctaatt9300
aggaacattatgtctctgacaggccctgatttccctctagaggaggcccctgtcttcaaa9360
aggacggggtcagccttgcataggttcaagtctgccagatacagcgaaggagggtattct9420
tctgtctgcccgaacctcctctctcatatttctgttagtacagacaccatgtctgatttg9480
acccaagacgggaagaactacgatttcatgttccagccattgatgctttatgcacagaca9540
tggacatcagagctggtacagagagacacaaggctaagagactctacgtttcattggcac9600
ctccgatgcaacaggtgtgtgagacccattgacgacgtgaccctggagacctctcagatc9660
ttcgagtttccggatgtgtcgaaaagaatatccagaatggtttctggggctgtgcctcac9720
ttccagaggcttcccgatatccgtctgagaccaggagattttgaatctctaagcggtaga9780
gaaaagtctcaccatatcggatcagctcaggggctcttatactcaatcttagtggcaatt9840
cacgactcaggatacaatgatggaaccatcttccctgtcaacatatacggcaaggtttcc9900
cctagagactatttgagagggctcgcaaggggagtattgataggatcctcgatttgcttc9960
ttgacaagaatgacaaatatcaatattaatagacctcttgaattggtctcaggggtaatc10020
tcatatattctcctgaggctagataaccatccctccttgtacataatgctcagagaaccg10080
tctcttagaggagagatattttctatccctcagaaaatccccgccgcttatccaaccact10140
atgaaagaaggcaacagatcaatcttgtgttatctccaacatgtgctacgctatgagcga10200
gagataatcacggcgtctccagagaatgactggctatggatcttttcagactttagaagt10260
gccaaaatgacgtacctatccctcattacttaccagtctcatcttctactccagagggtt10320
gagagaaacctatctaagagtatgagagataacctgcgacaattgagttctttgatgagg10380
caggtgctgggcgggcacggagaagataccttagagtcagacgacaacattcaacgactg10440
ctaaaagactctttacgaaggacaagatgggtggatcaagaggtgcgccatgcagctaga10500
accatgactggagattacagccccaacaagaaggtgtcccgtaaggtaggatgttcagaa10560
tgggtctgctctgctcaacaggttgcagtctctacctcagcaaacccggcccctgtctcg10620
gagcttgacataagggccctctctaagaggttccagaaccctttgatctcgggcttgaga10680
gtggttcagtgggcaaccggtgctcattataagcttaagcctattctagatgatctcaat10740
gttttcccatctctctgccttgtagttggggacgggtcaggggggatatcaagggcagtc10800
ctcaacatgtttccagatgccaagcttgtgttcaacagtcttttagaggtgaatgacctg10860
atggcttccggaacacatccactgcctccttcagcaatcatgaggggaggaaatgatatc10920
gtctccagagtgatagatcttgactcaatctgggaaaaaccgtccgacttgagaaacttg10980
gcaacctggaaatacttccagtcagtccaaaagcaggtcaacatgtcctatgacctcatt11040
atttgcgatgcagaagttactgacattgcatctatcaaccggatcaccctgttaatgtcc11100
gattttgcattgtctatagatggaccactctatttggtcttcaaaacttatgggactatg11160
ctagtaaatccaaactacaaggctattcaacacctgtcaagagcgttcccctcggtcaca11220
gggtttatcacccaagtaacttcgtctttttcatctgagctctacctccgattctccaaa11280
cgagggaagtttttcagagatgctgagtacttgacctcttccacccttcgagaaatgagc11340
cttgtgttattcaattgtagcagccccaagagtgagatgcagagagctcgttccttgaac11400
tatcaggatcttgtgagaggatttcctgaagaaatcatatcaaatccttacaatgagatg11460
atcataactctgattgacagtgatgtagaatcttttctagtccacaagatggttgatgat11520
cttgagttacagaggggaactctgtctaaagtggctatcattatagccatcatgatagtt11580
ttctccaacagagtcttcaacgtttccaaacccctaactgacccctcgttctatccaccg11640
tctgatcccaaaatcctgaggcacttcaacatatgttgcagtactatgatgtatctatct11700
actgctttaggtgacgtccctagcttcgcaagacttcacgacctgtataacagacctata11760
acttattacttcagaaagcaagtcattcgagggaacgtttatctatcttggagttggtcc11820
aacgacacctcagtgttcaaaagggtagcctgtaattctagcctgagtctgtcatctcac11880
tggatcaggttgatttacaagatagtgaagactaccagactcgttggcagcatcaaggat11940
ctatccagagaagtggaaagacaccttcataggtacaacaggtggatcaccctagaggat12000
atcagatctagatcatccctactagactacagttgcctgtgaaccggatactcctggaag12060
cctgcccatgctaagactcttgtgtgatgtatcttgaaaaaaacaagatcctaaatctga12120
acctttggttgtttgattgtttttctcatttttgttgtttatttgttaagcgt12173