本试剂盒采用酶联免疫吸附实验双抗夹心法检测样本中蛋白A的浓度。首先将样本或者标准品加入预包被有鸡抗蛋白A抗体的微孔中，利用抗原抗体特异性结合的特点在特定条件下孵育，使样本及标准品中的蛋白A被捕获于聚丙烯微孔板上。然后洗板，洗去其它未结合的物质，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗蛋白A抗体，37℃条件下孵育，使包被抗体、蛋白A及检测抗体形成双抗夹心复合物。洗板，加入显色底物溶液。显色结束后，加入硫酸溶液终止反应，颜色由蓝色变成黄色。样本或者标准品中蛋白A的含量与显色颜色深浅成正比，据此可以计算待检样本中蛋白A的含量。
三、试剂盒改进
(1)特异性高：包被抗体与检测抗体分别识别同一抗原的不同特异性表位，增加了反应的特异性。同类细胞因子之间没有交叉反应。
(2)敏感性高：检测抗体偶联生物素，与亲和素之间多价高亲和力，级联放大效应使得实验敏感度增加。
(3)稳定性高：实验采用的是优质的包被抗体和抗原，并使用了特定的广谱蛋白稳定剂，和微孔板处理工艺，增加微孔板热稳定性和结果的可重复性。
(4)样本稀释液优化：使用针对人血清样本优化后的特异性的缓冲液，排除样本基质干扰，适用于血清，血浆等常规样本的细胞因子定量检测。
四、提供的试剂及材料
请将请按照试剂标签提示的贮存条件存放试剂，并请在保质期前使用。
名称
规格
数量
保存
1
已包被平底微孔板
96孔
1板（可拆卸）
2-8℃密封冷藏
2
标准品S1
500pg/ml
1瓶
2-8℃冷藏
3
标准品S2
250pg/ml
4
标准品S3
125pg/ml
5
标准品S4
62.5pg/ml
6
标准品S5
31.25pg/ml
7
标准品S6
15.63pg/ml
8
标准品S7
7.813pg/ml
9
标准品S8
0pg/ml
10
HRP标记抗体浓缩液（200×）
100ul
11
检测抗体稀释液
11ml
12
TMB
2-8℃避光冷藏
13
终止液
6ml
14
洗液（100×）
10ml
15
样本稀释液
2瓶
16
封口膜
4张
17
使用说明书
1份
五、实验需要但试剂盒未提供的的材料
1)10-1000μl移液器及一次性灭菌吸头6)多道移液器
2)灭菌的去离子水或超纯水1L7)灭菌EP管
3)吸水纸8)酶标仪
4)高速离心机9)洗板机或者洗瓶
5)恒温箱或水浴锅(37℃/80℃)10)数据分析及绘图软件
11)PBS(pH7.4)的配制比例：NaH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，NaCl8g，KCl0.2g，用蒸馏水稀释至1000mL。
12)PBST配制方法：PBS+0.05%Tween-20。
六、样本收集和保存
1)血清：血液采集时不加抗凝剂，室温静置1-2小时，1000×g（或3000rpm）离心15分钟，取上清，-20℃或-80℃分装保存备用。
2)血浆：血液采集时要加入总体积1%的抗凝剂（EDTA、肝素等），采集后先室温或4℃静置半小时后，1000×g（或3000rpm）离心15分钟，取上清，-20℃或-80℃分装保存备用。
3)组织裂解液：组织裂解的方式取决于组织的类型，一般来讲，先用预冷的PBS清洗组织后称重。一般0.3g-0.5g组织加入500μL预冷的PBS，在冰上的玻璃容器内研碎。用超声或者反复冻融的方法裂解细胞膜，1500×g（或5000rpm）离心15分钟分钟后取上清，-20℃或-80℃分装保存备用。
4)细胞裂解液：悬浮细胞直接离心取细胞沉淀。贴壁细胞需用胰酶消化后离心取细胞沉淀。检测某些指标时不能用胰酶消化。用PBS洗3遍。用少量PBS重悬细胞，超声或者反复冻融的方法裂解细胞膜，1500×g（或5000rpm）离心15分钟分钟后取上清，-20℃或-80℃分装保存备用。
5)细胞上清液：收集培养的细胞，1000×g（或3000rpm）离心15分钟，取上清，-20℃或-80℃分装保存备用。
样本准备注意事项：
u样本收集完毕后，要分装保存在-20°C(少于3个月)或-80°C(少于6个月)以保持蛋白活性和避免污染。避免反复冻融如果要在24小时内分析样本，可以保存在2-8°C。
u某些化学裂解液可能会对本实验造成干扰，比如SDS，Triton。谨慎使用。
u样本液中含有沉淀物会对ELISA有干扰，务必离心去除。
u不要使用高脂血或溶血的样本，对ELISA有干扰，导致检测结果不准确。
u不能加热来融化样本。
七、实验前的准备
1)请仔细阅读试剂盒说明书，将水浴锅或恒温箱温度设置为37℃。
2)样本的准备：将化冻后的冻存样本，混匀后，12000rpm离心1min，取上清作为待检样本备用。
3)样本的稀释倍数：如果您的样本预测浓度高于本试剂盒最高检测限度，建议使用PBS对样本进行稀释。
注意:
u若您使用说明书中未列举的样本，请进行预实验看本试剂盒是否适合您的实验。
u实验样本的最佳PH值在7.0-7.4之间。
八、试剂的准备
1)实验前请将所有试剂及样本恢复到室温(20-25℃）。
2)洗液的稀释：量取10ml100×洗液母液，加入990ml去离子水或超纯水，混匀备用。如果浓缩液中有少许结晶，请将其置于室温，并轻轻震荡至晶体完全溶解。1×洗液在2-8℃中可以稳定保存2周。
3)样本的准备：待水浴锅上升到80℃且温度稳定时，将样本（纯化的IgG或者未完全纯化的IgG溶液）水浴2min，恢复到室温混匀后，12000rpm离心1min，取上清作为待检样本备用。
九、实验步骤
1)撕开包装袋，取出包被有抗体的酶标板，拆下不需要使用的板条，并用封口膜封好，放回铝箔袋，重新放回4℃保存。（板架可重复使用）
2)向微孔板中加入8个标准品各100ul，向其余微孔中加入100ul的准备好的分析样本溶液。贴上封口膜，37℃孵育1.5h。
3)洗板机洗板：
A取出稀释好的洗液放置于洗板机的洗瓶中备用。
B取出上步中的微孔，甩去微孔中的液体，洗板机洗板5次。
C洗板完成后，将微孔板倒扣在吸水纸上拍打，充分拍干至无明显水膜为止。
或手动洗板：
A取出稀释好的洗液放置于洗瓶中备用。
B取出上步中的微孔，甩掉微孔中的液体，在吸水纸上轻轻拍打至无明显液滴。
C用多道移液枪向每个微孔中加300ul洗液，静置20s，倒去洗液，将微孔板倒扣在吸水纸上轻轻拍打,重复5次。注：第五次洗板时，充分拍干至无明显水膜为止。
4)加检测抗体：取55ul检测HRP标记抗体浓缩液（200×）加入对应的稀释液瓶中，轻轻震荡混匀，使其充分稀释至工作浓度后（1×），各孔加100ul溶液，贴上封口膜，37℃孵育1h。然后洗板，按步骤3操作。
5)显色：向每个孔中加入100ul底物TMB，轻轻震荡30s混匀，贴上封口膜，置于避光的37℃恒温培养箱中显色10-30min。
6)显色终止及读板：直接向含有底物的微孔中加入50ul的终止液，终止反应，轻轻震荡混匀，立即转移到酶标仪上，在450nm下读取吸光度值。
十、注意事项
（一）样本收集注意事项
1、样本收集完毕后，要分装保存在-20℃（少于3个月）或-80℃（少于6个月）以保持蛋白活性，避免污染和反复冻融。如果要在24小时内分析样本，可以保存在2-8℃。
2、采集样本后如果短期内不使用，请将样本分装后冷冻保存，避免反复冻融。冷冻样本使用前请保证充分化冻，使用前用移液器或者Vortex混匀，可离心除去絮状不溶物。
3、若母液（标准品，检测抗体及酶液）出现浑浊，轻轻振荡或吹打即可。
4、建议所有标准品及样本都设置复孔。向微孔中加入试剂或样本后，请轻轻震荡使液体混匀，并尽量保证不要有气泡。
5、高脂血或溶血的样本含有丰富的过氧化物酶，对ELISA有干扰，导致检测结果非特异性升高，不建议使用。
（二）实验操作注意事项
1、请不要将本试剂盒的试剂与其他试剂盒试剂交叉使用。
2、实验操作使用一次性吸头，避免交叉污染。
4、洗涤：洗涤时微孔中残留的洗涤液应在吸水纸上充分拍干，并要消除板底残留的液体和手指痕迹，避免影响最后的酶标仪读数。
7、本试剂盒中使用了稀硫酸作为终止液，其具有轻微腐蚀性，使用时应避免接触衣物或眼、手等皮肤暴露部位。
8、标准曲线的R2≥0.95。
9、拍板示意图:
十一、数据处理
1)对样本及标准品各自对应的复孔OD值取平均值。减去空白孔（即S8）OD值后带入标曲。
2)以标准品的OD作为Y值，标准品的浓度作为X值，推荐选择四参数logistic(4-PL)曲线拟合。
3)将样本OD代入到标准曲线方程中计算样本中待检SPA的浓度
4)以下曲线仅供参考
十二、质量控制
1)批内差CV%:4-83)批间差CV%:8-10
2)回收率%:67.36-115.924)线性:
稀释倍数
Range%
AverageLinearity%
98.25-105.77
102.01
40
100.68-109.74
105.21
3)灵敏度:1.4pg/ml
4)特异性/交叉反应性:
Sample
Crossreactivity（%）
BovineIgG
---
GoatIgG
HumanIgG
5)勾状效应（HookCapacity）
本试剂盒是一个三步法的夹心ELISA试剂盒，样本在高含量蛋白A的情况下会受到钩状效应的影响，请用试剂盒稀释液稀释样本，使其蛋白A浓度在本试剂盒的检测范围以内。
6)局限性
本试剂盒不适用于含有叠氮化钠(NaN3)的样本，因为叠氮化钠是HRP的强抑制剂，会降低检测到的蛋白A浓度。
十三、安全注意事项
1)本试剂盒显色底物TMB3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB)，有一定的致病风险。如果接触到TMB，请用大量的水冲洗。
2)终止液是硫酸溶液，请勿让眼睛皮肤及衣物接触终止液。操作时带上手套，实验服及面罩。
应用：定量检测生物医药生产纯化过程中SPA残留检测（如纯化发酵液，细胞培养上清液等）