细菌形态学鉴定16SrDNA鉴定生理生化鉴定
一、细菌形态学鉴定
1.从-80冰箱中取出菌株放4复苏，轻柔混匀后用接种环接一环
2.放入培养箱倒置培养，实验室一般采用28培养，特殊菌株依据
3.纯化：从活化培养基平板上挑取单菌落继续划板培养。
4.观察记录菌落形态特征：大小（mm）、形状、干湿、透明度、颜色、边缘整齐还是，，，，，，，
形状干湿透明度颜色边缘细菌大小
（mm）
注意事项：
①接种划线应在酒精灯旁边操作
②培养时应倒置培养，防止污染
二、革兰氏染色
1.涂片固定
将纯化后的菌株进行革兰氏染色，滴一滴生理盐水于载玻片上，无菌条件下用接种环挑取少量菌落均匀涂布水滴中，使其自然干燥，菌面向上，经火焰固定。
注意事项：菌液涂片时不可过于浓厚，干燥、固定。固定时通过火焰1~2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2.染色
一般包括初染、没染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：（1）加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。
（2）加上碘液染色1分钟，水洗。
（3）加上95%酒精，摇动玻片，根据涂片厚度，脱色约20~60秒，水洗，吸去水分。
（4）加上蕃红后，染色1分钟，水洗。
（5）吸干或在空气中晾干后，油镜镜检。
3.结果观察：革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以均匀
分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，都常呈现假阳性。
②玻片通过火焰温度不能太高。
③碘液变透明，则不能使用。
④水洗时动作要轻，沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗，以免把菌体冲掉。
三、16SrDNA鉴定
（16SrDNA只能鉴定到属，需进行生理生化、药敏实验等鉴定到种）1.细菌复苏、活化、纯化同细菌形态学鉴定
3.挑取单菌落至少2-3个接到含有1ml灭菌纯水的1.5ml离心管中混匀。
4.沸水浴10min，12000rmp离心2min，取1.5ul上清作为模板，上下游引物各0.5ul加到23ul体系中，每个样品做3个平行，进行PCR扩增。
①使用离心机时一定要配平，防止损坏离心机。
②实验前所用离心管、纯水、枪头要灭菌后使用。
（若结果不理想则用改良方法）
1．收集菌体，或直接从平板上刮取细菌（直径约1.5-2mm左右大小菌落的菌量），加入含20ul0.1-0.5%TritonX-100的200ulPCR管中，充分重悬。
2．对于较难散开的细菌则可采用500ul体积（同样含0.1-0.5%TritonX-100），使用超声重悬（菌体相应增加），处理后取出20ul加入200ul
PCR管中。
3.将上述PCR管置于沸水中水浴处理5分钟，短暂离心（约30s）后，取1ul作为模板加入20ul（或25ul）体系中，进行PCR扩增。
0.1-0.5%TritonX-100的配置：
①30%储备液的配置
TritonX-1001.41ml
0.1mol/LPBS(pH=7.3)3.64ml
充分混合后，置37℃～40℃水浴中2～3h，使其充分溶解混匀，备用。
②用前取该储备液稀释至所需浓度，取1-5ul储备液加入300ul双蒸水中。
普通PCR体系：（23ul反应体系）50管×PCR体系配制
ddH2O918.5ul
10×buffer125ul
dNTP100ul
rTaq6.5ul
1.配制体系所用的200μlPCR管、1.5ml离心管、纯水、1ml枪头、
200μl枪头、10μl枪头均需灭菌，且在无菌操作台中操作。
2.配制体系前先将50个200μl的PCR管放在冰盒上预冷。
3.取一个无菌的1.5ml离心管，依次将药品加入管中，在漩涡混合
器上混合5~10秒。
4.每23μl分装入200μlPCR管中，放-20备用。
5.使用体系之前先验证体系是否好用。
例如：取实验室已知菌加16s上下游引物进行PCR反应，电泳后凝胶成像系统观察是否有已知条带。
（1）10×buffer、dNTP、rTaq用完尽快放回-20保存。
（2）无菌操作
PCR程序：
945min
9430s
35个循环5530s
721min30s
7210min
41min
PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳
1.先安装配胶槽，再将梳子插到槽中
2.缓冲液的配制：
（1）50×TAEBuffer储备液
Tirs12.1g、Na2EDTA.2H2O1.86g，加30ml去离子水搅拌溶解，
加醋酸2.855ml充分混匀，去离子水定容至50ml。
（2）1×TAEBuffer
取10ml50×TAEBuffer储备液加490ml的纯水，摇匀，待用。
3.配胶：
琼脂糖0.15g
缓冲液（1×TAE）15ml
加热煮沸3次
待温度降低到50~60时加入1滴核酸染液（GoldView）摇匀倒入槽内待胶凝固约30min。
4.拔出梳子，将凝胶放入水平电泳槽中，保证缓冲液没过梳孔。
5.上样：
（1）取3ul标准DNAMaker点入左边第一个梳孔，从左到右顺序点样。
（2）取一只塑料手套，将1ul6×Loadingbuffer点到手套上（3）取3ulPCR产物与1ul6×Loadingbuffer即3:1混匀点入梳孔。
6．盖上电泳槽盖子，恒压120V电泳，至溴酚蓝跑到胶的1/3处停止电泳（约20min），用凝胶成像系统进行采集观察，其浓度与DNAMaker比较，即亮度和长度。
7.如果与预测结果相同时，填写送出测序的单子，并联系北京华大基因有限公司，同时将至少40μlPCR产物放4保存待测序公司来取样。