覃璐琪1，梁晓琳1，潘海博1，莫明规2，饶川艳1，聂梦琳1，梅丽华1，李全阳1*
1(广西大学轻工与食品工程学院,广西南宁,500004)2(柳州市康小乐牛奶有限公司，广西柳州,545007)
关键词干酪乳杆菌；罗伊氏乳杆菌；荧光定量PCR；定性检测；定量检测
干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)LTL1361、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)LTR1318分离纯化自广西巴马瑶族自治县一位身体健康、年龄超百岁的老人的粪便，已保藏于中国典型培养物保藏中心。保藏号：干酪乳杆菌LTL1361：CCTCCM2019018，罗伊氏乳杆菌LTR1318：CCTCCM2019017。大肠杆菌DH5α，本实验室保藏；载体pucm-T、T4DNALigase、Taq酶、WideRangeDNAMarker，TaKaRa公司；细菌DNA提取试剂盒、SYBRqPCRMasterMix，南京诺唯赞生物科技有限公司；SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒，生工生物工程(上海)股份有限公司。
实时荧光定量PCR仪器(LightCycler?96)，Roche公司；InfiniteMP200连续波长多功能微孔检测器，瑞士TECAN；BIO-RAD伯乐凝胶成像仪、BIO-RAD电泳仪、梯度PCR仪，MJBioRad。
1.2.1乳酸菌及样品DNA的提取
干酪乳杆菌LTL1361、罗伊氏乳杆菌LTR1318按照GB4789.35—2016《食品微生物学检验》[24]培养后，采用细菌DNA提取试剂盒提取，具体操作按说明书进行。
益生菌发酵乳DNA的提取，参考吴燕涛等[25]方法并改进：称取100mg发酵乳于2mL离心管，加入750μL去离子水、100mL质量分数18%柠檬酸钠和50μL1mol/LNaOH，4℃2000r/min离心5min，弃上清液，保留沉淀。向沉淀中加入200μL溶菌酶，37℃孵育1h，再使用细菌DNA提取试剂盒提取益生菌DNA。
1.2.2引物的设计
从Genbank中分别下载干酪乳杆菌和罗伊氏乳杆菌不同菌株及其他乳酸菌标准株的16SrDNA序列，然后利用DNAStar中MegAlign进行序列比对，寻找种内保守区域，利用Primer5.0进行引物设计。并通过GenBank中Blast检测引物特异性，获得干酪乳杆菌和罗伊氏乳杆菌的种属特异性引物。引物序列如下,干酪乳杆菌F:5′-GATGATGTTGGGGATTTTGCG-3′，R:5′-TATCATAAACCGGGAGATCCCA-3′;扩增片段为149bp。罗伊氏乳杆菌F:5′-GCGTTGATGTTGTTGAAGGAATGAGCTTTG-3′，R:5′-CATCAGCAATGATTAAGAGAGCACGGCC-3′;扩增片段为200bp。引物均由北京擎科生物有限公司合成。
1.2.3PCR反应条件
普通PCR:反应体系包括12.5μLTaKaRaTaqTMVersion2.0plusdye，10μmol/L上下游引物各1μL，去离子水补齐至20μL，每个体系中再添加2μLDNA模板。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃30s，53℃30s，72℃12s，30个循环；72℃延伸5min。
PCR产物检测方法：取5μLPCR产物，使用质量浓度10g/L琼脂糖凝胶和1×TE缓冲液中电泳30min,电压100V,然后采用凝胶成像系统拍照存档。
实时荧光定量PCR:实时荧光定量PCR反应体系为20μL，其中SYBRqPCRMasterMix10μL，10μmol/L上下游引物各0.4μL，DNA模板2μL，去离子水补足至20μL。反应程序：95℃预变性30s；95℃10s，60℃30s，40个循环。
1.2.4引物特异性的验证
分别提取随机抽查的市售样品1、样品2、样品3及自制益生菌发酵乳(干酪乳杆菌LTL1361、罗伊氏乳杆菌LTR1318及传统发酵剂发酵)的DNA作为PCR反应模板，利用1.2.2中设计合成的种属特异性引物进行PCR扩增，普通PCR反应体系和反应条件均按照1.2.3中所述条件进行，同时将扩增得到的PCR产物使用质量浓度10g/L的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.5干酪乳杆菌LTL1361、罗伊氏乳杆菌LTR1318的16SrDNA基因克隆
采用细菌DNA提取试剂盒分别提取干酪乳杆菌LTL1361、罗伊氏乳杆菌LTR1318的基因组DNA。并以基因组DNA作为PCR反应模板扩增，将扩增后的PCR反应产物纯化后与pucm-T连接并转化至DH5α感受态细胞，经过PCR鉴定并送去生工生物工程(上海)股份有限公司测序，检测正确获得的阳性克隆子分别命名为puc-LTL1361、LTR1318。
1.2.6外标准品的制备及标准曲线的建立
分别提取质粒标准品puc-LTL1361、LTR1318DNA，酶标仪测定A值后，按照公式(1)计算出拷贝数并做10倍系列稀释，将不同浓度标准品作为模板进行荧光定量PCR反应：
(1)
式中：K，拷贝数，copies/mL；ρ，标准品浓度，g/mL；MW为相对分子质量，dolton。
以不同浓度标准品拷贝数的对数作为横坐标，以荧光定量PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数(Ct)为纵坐标绘制标准曲线，为待测样品提供定量检测参照标准。并通过使用曲线的斜率以及应用公式(2)来确定扩增效率：
(2)
式中，E表示扩增效率；slope表示斜率。
1.2.7不同浓度益生菌的检测
为验证建立的荧光定量PCR检测方法是否可以在实际样品中进行检测以及检测结果的准确性，同时利用平板计数法和荧光定量PCR检测方法对不同浓度益生菌进行检测，并对分析结果进行比较。分别将干酪乳杆菌LTL1361和罗伊氏乳杆菌LTR1318培养至1010CFU/mL，再以10倍梯度法稀释菌液浓度至1010～10CFU/mL作为待检样品，每个样品平行测定3次。
使用GB4789.35—2016《食品微生物学检验乳酸菌计数》[24]对乳杆菌总数进行计数，参考RAVULA等[26]的方法使用LC琼脂培养基对干酪乳杆菌计数，罗伊氏乳杆菌计数为两者相减后所得。
荧光定量PCR检测：分别提取不同浓度菌液核酸，并以该核酸为模板进行实时荧光定量PCR反应。
1.2.8实际市售样品的检测
采用LightCycler?96SW1.1软件进行荧光定量PCR图谱解析；采用GraphPadPrism8用于统计学分析和作图。
构建的质粒标准品PCR鉴定结果见图1。由图1-a可知,泳道1、2分别在149bp大小处得到单一条带，其大小与目的片段相同；由图1-b可知,泳道1、2分别在200bp大小处得到单一条带，其大小与目的片段相同；同时将puc-LTL1361、puc-LTR1318测序结果与目的片段基因序列对比，得到结果完全一致。上述结果表明：阳性克隆子puc-LTL1361及LTR1318构建成功，可用于后续实验。
M-markerDL500；a：1和2-puc-LTL1361；b：1和2-LTR1318；a-puc-LTL1361标准品鉴定;b-puc-LTR1318标准品鉴定图1质粒标准品的PCR鉴定结果Fig.1PCRidentificationresultsofplasmidstandard
如图2所示，使用1.2.2中设计的干酪乳杆菌特异性引物对市售样品进行PCR扩增，将扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳检验。结果表明，泳道2、泳道3在149bp处未出现特征条带，结果显示为阴性，表明样品1、样品2不含干酪乳杆菌；泳道4、泳道5分别在149bp处出现特征条带，与泳道6阳性对照一致，表明样品3及泳道5自制益生菌发酵乳中含有干酪乳杆菌。根据样品标签信息标识：市售样品1、样品2中仅含嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌，样品3含有干酪乳杆菌，自制益生菌发酵乳中含有干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌及传统发酵剂。使用该引物扩增，仅能特异性扩增出含有干酪乳杆菌基因片段样品，说明引物特异性良好，能够对样品中的干酪乳杆菌准确定性检测。
M-MarkerDL500;1-阴性对照；2-样品1;3-样品2;4-样品3;5-自制益生菌发酵乳；6-LTL1361图2样品中干酪乳杆菌的定性检测Fig.2QualitativedetectionofL.caseiinsamples
如图3所示，使用1.2.2中设计的罗伊氏乳杆菌特异性引物对样品进行PCR扩增，将扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳检验。结果表明，泳道2、泳道3在200bp处未出现特征条带，结果显示为阴性，表明样品1、样品2、样品3中不含罗伊氏乳杆菌；泳道5在200bp大小处出现特征条带，与泳道6阳性对照一致，表明泳道5自制益生菌发酵乳中含有罗伊氏乳杆菌。根据样品标签信息，使用该引物扩增，仅能特异性扩增出含有罗伊氏乳杆菌基因片段样品，说明引物特异性良好，能够对样品中的罗伊氏乳杆菌准确定性检测。
M-MarkerDL500;1-阴性对照；2-样品1；3-样品2；4-样品3；5-自制益生菌发酵乳；6-LTR1318图3样品中罗伊氏乳杆菌的定性检测Fig.3QualitativedetectionofL.reuteriinsamples
利用荧光定量PCR检测方法测定不同菌液Ct值并代入2.3所建标准曲线方程中计算得到PCR检测结果，同时使用平板培养法对样品进行计数，所得结果见表1。
表1荧光定量PCR检测结果与平板计数结果的比较Table1ComparisonoffluorescencequantitativePCRtestresultsandplatecountresults
菌液浓度(CFU/mL)干酪乳杆菌罗伊氏乳杆菌荧光定量PCR检测(copies/μL)对数结果平板计数(CFU/mL)对数结果荧光定量PCR检测(copies/μL)对数结果平板计数(CFU/mL)对数结果101UD-65.00±2.651.81UD-57.33±0.421.76102UD-(5.23±0.35)×1022.72UD-(6.13±0.32)×1022.79103UD-(5.63±0.45)×1033.75UD-(7.33±0.25)×1033.88104(4.11±0.33)×1044.61(4.43±0.12)×1044.65(4.94±0.17)×1044.69(5.33±0.42)×1044.73105(5.41±0.19)×1055.73(5.83±0.23)×1055.77(6.82±0.24)×1055.83(7.13±0.40)×1055.85106(5.46±0.19)×1066.74(5.77±0.31)×1066.76(7.83±0.28)×1066.89(7.50±0.03)×1066.88107(6.41±0.08)×1077.81(5.93±0.31)×1077.77(6.93±0.48)×1077.84(6.23±0.15)×1077.79108(8.26±0.22)×1088.92(7.80±0.02)×1088.89(7.83±0.28)×1088.89(7.07±0.40)×1088.85
注：UD表示未检出;-表示无
由表1可知，当菌液浓度为10～104CFU/mL时，荧光定量PCR均没有明显的扩增信号，检测结果记为阴性；当菌液浓度为104～108CFU/mL时，可测得Ct值计算拷贝数。将荧光定量PCR检测结果与平板计数结果进行比较，检测结果并无显著性差异(P>0.05)，其结果对数值均在一个数量级上，与菌液实际浓度相符。以上结果表明，所建立的实时荧光定量PCR检测方法检测限为104CFU/mL,能够满足国标GB19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》中对发酵乳乳酸菌含量检测的要求，并且所建立的荧光定量PCR检测方法能够准确反映益生菌含量。
2.5.1实时荧光定量PCR检测结果分析
根据新建立的实时荧光定量PCR检测方法对市售样品进行检测，通过观察PCR扩增结果即可对样品进行定性检测。同时得到对应的样品Ct值(y)，将其代入2.3中所建标准曲线方程计算，即可对样品初始浓度(x)进行定量。所得结果见表2。
表2市售样品的实时荧光定量PCR检测结果Table2Real-timefluorescencequantitativePCRtestresultsofcommercialsamples
样品标识菌株信息扩增结果Ct值菌含量×10-9/(copies·μL-1)干酪乳杆菌罗伊氏乳杆菌干酪乳杆菌罗伊氏乳杆菌自制益生菌发酵乳嗜热链球菌-干酪乳杆菌+10.84±0.143.2±0.35罗伊氏乳杆菌+11.49±0.114.5±0.36保加利亚乳杆菌-市售样品1嗜热链球菌-保加利亚乳杆菌-市售样品2嗜热链球菌-保加利亚乳杆菌-市售样品3干酪乳杆菌≥+12.02±0.221.3±0.25108CFU/mL+
注：+表示有荧光扩增信号；-表示无荧光扩增信号；空白表示未检出
2.5.2荧光定量PCR反应检测系统的特异性分析
通过解读扩增产物的溶解曲线可对荧光定量PCR反应检测的特异性进行评价，不同扩增产物下的溶解曲线不同，可通过观察溶解曲线排除引物二聚体等非特异性干扰[31]。由图4可知,扩增产物的溶解曲线皆呈单一峰型且空白对照无起峰现象，表明定量体系特异性良好，所用引物及PCR反应条件都适合进行荧光定量PCR反应。
图4实时荧光定量PCR溶解曲线Fig.4Real-timefluorescencequantitativePCRdissolutioncurve
参考文献
[1]包秋华，陈永福，张家超，等.一种快速定性和定量检测发酵乳中L.fermentum的方法[J].中国乳品工业,2011,39(2):59-61.
[2]HERRAIZT,CHAPARROC.Humanmonoamineoxidaseenzymeinhibitionbycoffeeandβ-carbolinesnorharmanandharmanisolatedfromcoffee[J].LifeSciences,2006,78(8):0-802.
[3]YEONSW,YOUYS,KWONHS,etal.FermentedmilkofLactobacillushelveticusIDCC3801reducesbeta-amyloidandattenuatesmemorydeficit[J].JFunctfoods,2010,2(2):143-152.
[4]BHALLAM,INGLENA,KAURN,etal.Mutansstreptococciestimationinsalivabeforeandafterconsumptionofprobioticcurdamongschoolchildren[J].JIntSocPrevCommunityDent,2015,23(4):118-124.
[5]PAND,LUOY,TANOKURAM.Antihypertensivepeptidesfromskimmedmilkhydrolysatedigestedbycell-freeextractofLactobacillushelveticusJCM1004[J].FoodChemistry,2004,91(1):123-129.
[6]GOMIA,IINOT,NONAKAC,etal.HealthbenefitsoffermentedmilkcontainingBifidobacteriumbifidumYIT10347ongastricsymptomsinadults[J].JournalofDairyScience,2015,98(4):2277-2283.
[7]NOCERINOR,PAPAROL,TERRING,etal.Cow'smilkandricefermentedwithLactobacillusparacaseiCBAL74preventinfectiousdiseasesinchildren:Arandomizedcontrolledtrial[J].ClinicalNutrition,2015,36(1):118-125.
[8]何云侠.干酪乳杆菌微胶囊的制备及应用[D].西安:陕西科技大学,2019.
[9]魏升宁.益生菌豆奶产品的研制及微胶囊技术应用研究[D].长春:吉林农业大学,2011.
[10]任伟，杜晓华，何伟，等.鼠李糖乳杆菌在发酵乳中的应用[J].中国乳业,2019,(7):79-81.
[11]黄天，韩之皓，郭帅，等.益生菌山药饮料发酵工艺优化及其冷藏稳定性[J].食品工业科技,2019,40(15):129-134；142.
[12]张群.新型益生菌发酵乳制品的研究与开发[J].食品与生物技术学报,2015,34(6):672.
[13]李达,苗欣宇,牛红红,等.复合益生菌发酵果蔬饮料的研制[J].饮料工业,2019,22(6):32-37.
[14]王仙丽.干酪乳杆菌·张与嗜热链球菌混合发酵对发酵乳感官品质的影响[D].银川：宁夏大学,2019.
[15]赵志文,戴颖,王琴,等.单一及组合乳酸菌对发酵乳功能特性的影响[J].食品工业科技,2016,37(17):335-339.
[16]马雨璇,吴可非,桑跃,等.水牛奶中优良乳酸菌的筛选及复合菌株发酵研究[J].中国乳业,2016(5):74-77.
[17]孙纪录,韩军,于志彬,等.计数酸奶中常见益生菌的选择性和鉴别性培养基的研究进展[J].食品与发酵工业,2009,35(7):113-117.
[18]BONAPARTEC,KLEING,KNEIFELW,etal.Developmentofaselectiveculturemediumfortheenumerationofbifidobacteriainfermentedmilks[J].DairyScience&Technology,2001,81(1-2):227-235.
[19]王立平,刘晓莉,蔡雪凤,等.发酵乳活性双歧杆菌种类快速识别及定量研究[J].现代食品科技,2013,29(4):170-174.
[20]RAVIK,BLOMJ,PALVAA.ComparativegenomicsofLactobacillus[J].MicrobialBiotechnology,2011,4(21):125-134.
[21]肖其胜,杨捷琳,杨惠琴,等.实时荧光PCR法鉴定食品中双歧杆菌[J].食品科学,2016,37(20):177-182.
[22]张娜娜,刘洋,俞漪,等.乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌的实时荧光定量PCR检测方法[J].食品科学,2019,40(8):27-32.
[23]杨弘华,宋燕燕,林晓波,等.实时荧光定量PCR技术应用研究[J].山东化工,2016,45(22):46-47.
[24]GB4789.35—2016.食品微生物学检验乳酸菌计数[S].北京：中国标准出版社,2016.
[25]吴燕涛,刘晓莉,曹悦,等.实时荧光定量PCR法测定发酵乳中双歧杆菌[J].食品科学,2013,34(8):172-175.
[26]RAVULARR,SHAHNP.SelectiveenumerationofLactobacilluscaseifromyogurtsandfermentedmilkdrinks[J].BiotechnologyTechniques,1998,12(11):819-822.
[27]姜凯.基于流式细胞术的乳酸菌快速计数方法研究和活性判定[D].上海：上海师范大学,2018.
[28]杨莉婷,何丽,何海宁,等.流式细胞术对生乳中微生物检测的应用研究[J].广西师范大学学报(自然科学版),2017,35(2):112-116.
[29]杜耿记,金珠,吴小慧,等.流式细胞仪快速检测酸奶中乳酸菌含量[J].食品安全质量检测学报,2017,8(7):2810-2814.
[30]陈臣,周方方,任婧,等.特异性检测植物乳杆菌的多重PCR方法[J].南方农业学报,2013,44(7):1076-1080.
[31]包秋华,张家超,李梅花,等.一种快速定性和定量检测发酵乳中L.rhamnosus的方法[J].乳业科学与技术,2010(5):29-31.
[32]陈臣,任婧,艾连中,等.益生菌制品中植物乳杆菌ST—III快速定性、定量检测方法的建立[J].南方农业学报,2012,43(10):1443-1446.
QINLuqi1,LIANGXiaolin1,PANHaibo1,MOMinggui2,RAOChuanyan1,NIEMengLin1,MEILihua1,LiQuanyang1*
1(CollegeofLightIndustryandFoodEngineering，GuangxiUniversity，Nanning500004,China)2(LiuzhouKangxiaoleDairyCo.Ltd,Liuzhou545007,China)
ABSTRACTInordertorapidlyandaccuratelydetectthequantityandthequalityofLactobacilluscaseiandLactobacillusreuteriinprobioticfermentedmilk,adualreal-timefluorescencequantitativepolymerasechainreaction(PCR)detectionmethodwasestablishedbyselectingandoptimizingspecificamplificationprimersofL.caseiandL.reuteri.Theresultsshowedthattheestablishedstandardcurveequationhadagoodlinearrelationship,andthecorrelationcoefficientR2wasabove0.99.Randomsamplingofcommercialproductsshowedthatsample1and2didnotcontainL.caseiorL.reuteri.InDIYprobioticsfermentedmilk(3.7±0.35)×109copies/mLofL.caseiand(4.8±0.26)×109copies/mLofL.reuteriwasdetected,whileinsample3(1.39±0.25)×109copies/mLofL.caseiandnoL.reuteriwasdetected.Thedetectionresultswereconsistentwiththeknownprobioticspeciesandquantityinformation.Theaboveresultsshowedthatthereal-timefluorescencequantitativePCRmethodestablishedinthisstudycoulddetectthequantityandqualityofL.caseiandL.reuteriinprobioticfermentedmilkquicklyandaccurately.
KeywordsLactobacilluscasei；Lactobacillusreuteri；fluorescencequantitativePCR；qualitativedetection；quantitativedetection
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.023849
第一作者：硕士研究生(李全阳教授为通讯作者，E-mail：liquanyang@gxu.edu.cn)
基金项目：广西重点研发计划项目(桂科AB18221065)；国家自然科学基金资助项目(31871802)
收稿日期：2020-03-04，改回日期：2020-04-16
引用格式:覃璐琪，梁晓琳，潘海博，等.采用实时荧光定量PCR法同时定性定量检测发酵乳中多种益生菌[J].食品与发酵工业,2020,46(15):238-244.QINLuqi,LIANGXiaolin,PANHaibo,etal.SimultaneouslyqualitativeandquantitativedetectionsofprobioticsinfermentedmilkusingqPCR[J].FoodandFermentationIndustries,2020,46(15):238-244.