本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种犬瘟热病毒荧光ema检测引物组、试剂盒和检测方法。
背景技术：
犬瘟热(caninedistemper)是由犬瘟热病毒(caninedistempervirus，cdv)引起的一种高度接触性传染病，传染性极强，死亡率可高达80％以上，根据国家农业部于2008年12月11日公布的动物疫病名录统计，犬瘟热属三类动物疫病，主要感染犬科及猫科动物，传染渠道主要是通过与病兽直接接触传染，也可通过空气或食物传染，不属于人畜共患病。
犬瘟热在自然条件下，不同年龄、性别和品种的犬均可感染，但以未成年的幼犬最为易感。另有研究表明除犬科动物外，鼬科，浣熊科，大熊猫科等多种动物也可感染发病，是当前对宠物饲养业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的疫病之一。一旦犬群发生本病，除非在绝对隔离条件下，否则其他幼犬很难避免感染。
犬瘟传统检测手段主要为病毒分离培养，elisa检测，免疫试纸条检测和rt-pcr检测等，但在这些检测方法中，病毒分离培养耗时较长，elisa检测和免疫试纸条检测则存在灵敏度不高或特异性不强等问题，目前多项专利采用rt-pcr或lamp方法，这些方法灵敏度和特异度都较高，但需要昂贵的仪器试剂，对操作者技术要求也较高，同时耗时较长，因此无法用于基层和现场检测。
技术实现要素：
为达到上述目的，本发明的技术方案是：犬瘟热病毒荧光ema检测引物组，包含上、下游引物和探针，所述上游引物是：5’-aaatctggcttgatattgttag-3’；所述下游引物是：5’-gagccggatacatagtttcaa-3’；所述探针是5’-ccccagggaacaagcctac/i6-famdt/ga/idsp/a/ibhq1dt/gatttgt-3’c3spacer。其中：“i6-famdt”指6-fam(6-羧基荧光素)荧光标记的dt核苷酸，“idsp”指碱基缺失，“ibhq1dt”指带有bhq1淬灭基团标记的dt核苷酸，“c3spacer”指3’羟基封闭。
其中，所述引物组中的上、下游引物和探针可以是与权利要求1所述上、下游引物和探针的序列同源性大于85％的序列；或者是与权利要求1所述上、下游引物和探针的序列碱基互补的序列。
本发明还提供犬瘟热病毒荧光ema检测试剂盒，所述试剂盒包括以下内容：
(1)复溶液；
(2)含引物的冻干酶管；所述引物包含上、下游引物和探针，所述上游引物是：5’-aaatctggcttgatattgttag-3’；所述下游引物是：5’-gagccggatacatagtttcaa-3’；所述探针是5’-ccccagggaacaagcctac/i6-famdt/ga/idsp/a/ibhqldt/gatttgt-3’c3spacer；
(3)阳性对照品；
(4)阴性对照品。
其中，所述复溶液的成分如下：每30ml复溶液中含0.1-2m的mgac2840μl、0.1-2mph8.0的tris-ac3.00ml、0.1-2m的dtt150μl、无rnase水26.01ml。
优选的，所述复溶液的成分如下：每30ml复溶液中含1-2m的mgac2840μl、1-2mph8.0的tris-ac3.00ml、1-2m的dtt150μl、无rnase水26.01ml。
其中，所述含引物的冻干酶管的成分如下：每4ml冻干酶管中含有1000～3000ng/ul的单链dna结合蛋白178μl、10-100ng/ul10-100mm的atp再生蛋白75μl、200-2000ng/ul的dna解旋酶259μl、100-1000ng/ul的dna聚合酶75μl、100-1000ng/ul的dna限制性内切酶200μl、10-300ng/ul的辅助蛋白30μl、50-500ng/ul的m-mlv逆转录酶400μl、500-5000ng/ul的rnase抑制剂10μl、10-100μm的上游引物5μl、10-100μm的下游引物5μl、10-100μm的探针15.5μl、1-10m的磷酸肌酸钠144μl、10-100mm的atp144μl、5-50mm的dntp62μl、0.1-2mph8.0的tris-ac21.57ul、海藻糖0.14g、kac0.02g、纯化水360μl。
优选的，所述含引物的冻干酶管的成分如下：每4ml冻干酶管中含有1500-2500ng/ul单链dna结合蛋白178μl、20-50ng/ulatp再生蛋白75μl、300-600ng/uldna解旋酶259μl、300-600ng/uldna聚合酶75μl、300-600ng/uldna限制性内切酶200μl、50-100ng/ul辅助蛋白30μl、100-200ng/ulm-mlv逆转录酶400μl、1000-2000ng/ulrnase抑制剂10μl、100μm上游引物5μl、100μm下游引物5μl、10μm探针15.5μl、1m磷酸肌酸钠144μl、80-100mmatp144μl、25mmdntp62μl、ph8.0的1-2mtris-ac21.57ul、海藻糖0.14g、kac0.02g、纯化水360μl。
其中，所述阴性对照品为无rnase水空白对照。
其中，所述阳性对照品为犬瘟热伪病毒，浓度是1μg/ml。
本发明还提供犬瘟热病毒快速检测方法，所述犬瘟热病毒快速检测方法采用本发明所述的犬瘟热病毒核酸快速检测试剂盒，所述犬瘟热病毒快速检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的；所述犬瘟热病毒快速检测方法包括以下步骤：：
(1)提取样本中病毒rna；
(2)使用本发明的检测试剂盒，取10μl复溶液及10μl步骤(1)提取的病毒rna，加入到含引物的冻干酶管中，充分混匀；
(4)结果分析。
其中，所述结果分析是：如果样本扫描荧光曲线为典型“s”型，则判断为阳性结果；反之，则为阴性结果。
其中，所述样本可以是待测犬的血液、分泌物、排泄物或脑、肺脏、脾脏、肠系膜淋巴结等组织。
本发明使用常温核酸扩增技术，通过m-mlv逆转录酶、rnase抑制剂、dna解旋酶、单链dna结合蛋白、dna聚合酶等多个酶促反应，可在37-45℃恒温条件下，10-30分钟内使待检rna逆转录成cdna，并将cdna扩增数百万倍，配合荧光检测技术，可以实现对待检rna的快速检定。
本发明的引物序列是这样得到：从ncbi中下载犬瘟热病毒基因组序列(序列号ay466011.2)，通过oligo7软件设计引物，以含目的序列的质粒为模板，通过凝胶电泳筛选最适引物。筛选标准：引物灵敏度至少到10-4ng、副反应尽量少。筛选好引物后，以上下游引物中间的序列设计一条探针。
从而得到本发明所含引物对及探针：
上游引物：5’-aaatctggcttgatattgttag-3’；
下游引物：5’-gagccggatacatagtttcaa-3’；
探针：5’-ccccagggaacaagcctac/i6-famdt/ga/idsp/a/ibhq1dt/gatttgt-3’c3spacer。
本发明的有益效果包括：
1、本试剂盒中反应体系经过冻干处理，可常温保存和运输，免去了低温保存、冷链运输的设备要求；
2、本发明中逆转录与dna复制一步完成，核酸扩增条件为37℃到42℃，对温度要求低，对机器要求较低；
4、本发明中核酸扩增产物不经历开盖操作，降低了污染的风险。
附图说明
图1是阴、阳性样本测试结果示意图。其中，①具有典型“s”型，为阳性结果，②为水平线，不具有典型“s”型特征，为阴性结果。
图2是实施例2测试结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明，所选配方为试剂盒的优选配方，但并不用来限制本发明的范围。
犬瘟热病毒荧光ema检测引物组，包含上、下游引物和探针，所述上游引物是：5’-aaatctggcttgatattgttag-3’；所述下游引物是：5’-gagccggatacatagtttcaa-3’；所述探针是5’-ccccagggaacaagcctac/i6-famdt/ga/idsp/a/ibhq1dt/gatttgt-3’c3spacer。其中：“i6-famdt”指6-fam(6-羧基荧光素)荧光标记的dt核苷酸，“idsp”指碱基缺失，“ibhq1dt”指带有bhq1淬灭基团标记的dt核苷酸，“c3spacer”指3’羟基封闭。
(2)含引物的冻干酶管；所述引物包含上、下游引物和探针，所述上游引物是：5’-aaatctggcttgatattgttag-3’；所述下游引物是：5’-gagccggatacatagtttcaa-3’；所述探针是5’-ccccagggaacaagcctac/i6-famdt/ga/idsp/a/ibhq1dt/gatttgt-3’c3spacer；
其中，所述复溶液的成分如下：每30ml复溶液中含0.1-2m的mgac2840μl、0.1-2mph8.0的tris-ac3.00ml、0.1-2m的dtt150μl、无rnase水26.01m1。
本发明试剂盒中的复溶液、含引物的冻干酶管具有以下的组分含量时，具有更佳的检测效果：
优选的，所述复溶液的成分如下：每30ml复溶液中含1-2m的mgac2840μl、1-2mph8.0的tris-ac3.00ml、1-2m的dtt150μl、无rnase水26.01ml
本发明还提供犬瘟热病毒快速检测方法，所述犬瘟热病毒快速检测方法采用所述的犬瘟热病毒核酸快速检测试剂盒，所述犬瘟热病毒快速检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的；所述犬瘟热病毒快速检测方法包括以下步骤：：
(2)使用权利要求3所述的检测试剂盒，取10μl复溶液及10μl步骤(1)提取的病毒rna，加入到含引物的冻干酶管中，充分混匀；
(4)结果分析：如果样本扫描荧光曲线为典型“s”型，则判断为阳性结果；反之，则为阴性结果(如图1)。
其中，样本可以是待测犬的血液、分泌物、排泄物或脑、肺脏、脾脏、肠系膜淋巴结等组织。
实施例1，犬瘟热病毒荧光ema检测
采用犬瘟热病毒荧光ema检测试剂盒进行犬瘟热病毒的检测。所述犬瘟热病毒荧光ema检测试剂盒包括：
1、复溶液500μl；
复溶液每30ml含有：
2、含引物的冻干酶管48头份；
每4ml冻干混合液包含以下各组分：
其中，引物对及探针的序列如下：
3、阴性对照品为无rnase水空白对照。
4、阳性对照品为犬瘟热伪病毒，浓度是1μg/ml。
犬瘟热病毒荧光ema检测步骤如下：
(2)使用上述犬瘟热病毒荧光ema检测试剂盒，取10μl复溶液及10μl步骤(1)提取的病毒rna，加入到含引物的冻干酶管中，充分混匀；
(4)结果分析：如果样本扫描荧光曲线为典型“s”型，则判断为阳性结果；反之，则为阴性结果。
检测结果见图1，其中，①具有典型“s”型，为阳性结果，②为水平线，不具有典型“s”型特征，为阴性结果。
实施例2：临床样本的检测：
采用犬瘟热病毒荧光ema检测试剂盒进行犬瘟热病毒临床样本的检测。所述犬瘟热病毒荧光ema检测试剂盒包括：
同时用两个市售品牌的pcr法检测试剂盒做为对比例，本发明与这两个市售品牌的pcr法检测试剂盒检验一致率均为100％。证明本发明灵敏度与特异度与市售产品基本一致，但是在耗时及成本上，本发明更具有优势。
实施例3：特异性检测：
用犬细小病毒、犬腺病毒1型、犬腺病毒2型、犬副流感病毒、犬钩端螺旋体、犬冠状病毒核酸，以犬瘟热病毒阳性样本为对照，进行本发明特异性的检测，结果显示只有犬瘟热病毒阳性样本为阳性结果，而其他样本均为水平线，为阴性结果，证明本发明与犬细小病毒、犬腺病毒1型、犬腺病毒2型、犬副流感病毒、犬钩端螺旋体、犬冠状病毒不存在交叉反应。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110>苏州点晶生物科技有限公司
<120>犬瘟热病毒荧光ema检测引物组、试剂盒和检测方法