宋阳威，王云飞，赵轩，房超，孙慧宇
（徐州出入境检验检疫局，江苏徐州221000）
摘要：建立水产品中4种兽药残留检测方法，并对市售水产品进行检测，为食品安全监管提供参考依据。随机采集市售鲜活鱼虾121份，检测氯霉素、硝基呋喃类及其代谢物、孔雀石绿和恩诺沙星。121份鲜活鱼虾合格率89.26%。禁用药物中氯霉素没有检出，孔雀石绿（含隐性孔雀石绿）和硝基呋喃类及其代谢物有不同程度的检出，其中孔雀石绿的检出率较高，达到7.44%（9/121），最高检出值为621.6μg/kg；限量使用药物恩诺沙星检出率高达87.5%（49/56），但超标率仅为3.57%（2/56）。经过多年管控治理，氯霉素和硝基呋喃类药物已基本检测不到，限用药物恩诺沙星超标率也较低，但是廉价高效的孔雀石绿仍有检出，有必要加强监测和监管。
关键词：市售；鱼虾；兽药残留；检测；分析
API4000型液相串联质谱仪（liquidchromatography-massspectrometry/massspectrometry，LC-MS/MS）：美国AB公司；3-30KS低温高速离心机：北京博劢行仪器有限公司；SHA-B恒温水浴振荡器：常州亿通分析仪器制造有限公司；GM200粉碎机：德国RETSCH弗尔德（上海）仪器设备有限公司；R300旋转蒸发仪：瑞士步琦有限公司；N-EVAP氮吹浓缩仪：美国organomation公司。
氯霉素标准品（chloramphenicol，CAP），纯度98.5%；呋喃西林（nitrofural，SEM）、呋喃唑酮（furazolidone，AOZ）、呋喃它酮（furaltadone，AMOZ）标准品，纯度99%；呋喃妥因（nitrofurantoin，AHD）标准品，纯度98.4%；孔雀石绿标准品（malachitegreen，MG）、隐性孔雀石绿（leucomalachitegreen，LMG），纯度95.8%、恩诺沙星标准品（enrofloxacin，ENR），纯度99.0%：德国Dr.E公司；氯霉素-d5标准品（chloramphenicol-d5，CAP-d5），纯度98.6%、硝基呋喃类代谢物同位素混合内标溶液，氘、碳-13、氮-15标记的硝基呋喃类代谢物同位素标准品AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3、SEM-13C15N2、孔雀石绿（malachitegreen-D5，MG-D5）、隐性孔雀石绿内标物（leucomalachitegreen-D6，LMG-D6）、恩诺沙星内标（enrofloxacin-D5，ENR-D5）：德国Witega公司。
1.2.1采集点和采集方法
2017年3月～11月在徐州市区各大农贸市场随机采集鲜活鱼虾121份。主要采集常见的鲫鱼、鲤鱼、黄颡鱼、黑鱼、罗非鱼、鳊鱼、加州鲈鱼、草鱼、鳙鱼、沼虾和罗氏虾等11种鱼虾。样品由专业技术人员采集，采集时均为鲜活状态。
1.2.2检测项目
121份鱼虾均检测了孔雀石绿，其中65份还检测了氯霉素、硝基呋喃类及其代谢物等禁用药物，另外56份检测了限量使用药物恩诺沙星。
1.3.1样品制备
样品中取出有代表性样品约500g，取可食部分用粉碎机搅碎；将粉碎的样品混合均匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为待测样，密封，在-18℃条件下保存。
1.3.2前处理操作
1.3.2.1氯霉素
称取5g样品（精确到0.01g）于50mL具塞离心管中，加入CAP-d5内标溶液，加入20mL乙酸乙酯，高速均质2min，超声10min，然后以3500r/min离心5min，收集上清液，于45℃下旋转蒸发至近干，然后依次加入4mL正己烷和5.0mL水溶解，并转移至10mL试管中。振荡1min后离心，弃去有机相，取1mL水相，过滤膜（0.45μm）后上机测定。
1.3.2.2硝基呋喃类
称取2g样品（精确到0.01g）于25mL干净玻璃离心管中，加入同位素内标混合液，150μL邻硝基苯甲醛（50mmol/L），5mL水和0.5mL～1.5mL盐酸（1mol/L），调节pH＜2。漩涡振荡15s后，避光保存在37℃水浴中，振荡过夜（约16h）。取出离心管，冷却至室温，根据基质加入1mL～3mL磷酸氢二钾（1mol/L），精确调节pH值为7.0～7.5。加入8mL乙酸乙酯，涡旋20s，2500r/min离心5min～10min。将上层清液转移至10mL干净玻璃试管中，40℃氮吹至干。用1mL甲醇水溶液（1∶9，体积比）定容后，过滤膜（0.22μm）后上机测定。
1.3.2.3孔雀石绿
称取5g样品（精确到0.01g），加入MG-D5、LMGD6内标溶液，先加入孔雀石绿快速检测前处理试剂盒中的提取液1（液体20.0mL），用匀浆机以8000r/min速度均质30s，再加入提取液2（固体粉末），振荡1min，4000r/min离心5min，取上清液10.0mL于鸡心瓶中，再加入异丙醇10mL，50mL中，再水浴旋转蒸干，残留物用2.5mL流动相溶解，溶解液放入2.5mL离心管中，8000r/min，离心5min，过滤膜（0.45μm）后上机测定。
1.3.2.4恩诺沙星
称取5g样品（精确到0.01g）于50mL离心管中，加入ENR-D5内标溶液，用15mL含1%乙酸的乙腈溶液15℃以下超声提取5min，15℃以下3500r/min离心5min，收集上清液于另一洁净的离心管中。重复上述提取步骤1次，合并上清液，加入15mL正己烷，混合1min，于15℃以下3500r/min离心5min，弃去正己烷层。将下层乙腈转移入100mL平底烧瓶中，加入5mL异丙醇，混合均匀，于45℃减压蒸发至干。用5.0mL流动相溶解残渣，并转移至15mL离心管中，加入5mL正己烷，混合1min，于15℃以下3500r/min离心5min，弃去上层正己烷，下层过滤膜（0.45μm）后上机测定。
1.3.3色谱条件
1.3.3.1氯霉素
色谱柱：AgilentEclipseXDB-C18色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）；柱温：25℃；流速：0.5mL/min；进样量：25μL；流动相：A相为甲醇，B相为水；梯度洗脱程序：0～2min，A相保持30%；2.0min～3.5min，A相从30%线性升至90%，保持3.5min；0.1min内，A相降至30%，保持至4min；质谱参数：采用电喷雾离子源（electrosprayionization，ESI），负离子扫描模式（ESI-），多反应监测（multiplereactionmonitoring，MRM）；离子源喷雾电压：-4500V；离子源温度550℃。MRM监测离子对、去簇电压（declusteringpotential，DP）、碰撞电压（collisionenergy，CE）。
1.3.3.2硝基呋喃类
色谱柱：AgilentEclipseXDB-C18色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）；柱温：25℃；流速：0.5mL/min；进样量：25μL；流动相：A相为甲醇，B相为醋酸铵水溶液（1.0mmol/L，加入0.02%的甲酸）；梯度洗脱程序：0～2min，A相保持10%；2.0min～3.5min，A相从10%线性升至90%，保持3.2min；0.1min内，A相降至10%，保持至10min；质谱参数：采用电喷雾离子源（ESI），正离子扫描模式（ESI+），多反应监测（MRM）；离子源喷雾电压：5500V；离子源温度600℃。MRM监测离子对、去簇电压（DP）、碰撞电压（CE）。
1.3.3.3孔雀石绿
色谱柱：AgilentEclipseXDB-C18色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）；柱温：35℃；流速：0.6mL/min；进样量：25μL；流动相：A相为乙腈，B相为5mmol/L乙酸铵水溶液（用冰乙酸调节pH值为4.5，过0.2μm微孔滤膜）；梯度洗脱程序：0～5.0min，A相保持为85%；5.0min～7.0min，A相从85%线性升至95%，保持5min，0.2min内，A相降至85%，保持3.8min；质谱参数：采用电喷雾离子源（ESI），正离子扫描模式（ESI+），多反应监测（MRM）；离子源喷雾电压5500V；离子源温度550℃。MRM监测离子对、去簇电压（DP）、碰撞电压（CE）。
1.3.3.4恩诺沙星
色谱柱：AgilentEclipseXDB-C18色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）；柱温：30℃；流速：0.6mL/min；进样量：25μL；流动相：A相为含0.1%甲酸的水溶液，B相为含0.1%甲酸的乙腈；梯度洗脱程序：0～5.5min，A相从87%线性降至10%，保持2min。在0.1min内，A相升至87%，并保持6.4min；质谱参数：采用电喷雾离子源（ESI），正离子扫描模式（ESI+），多反应监测（MRM）；离子源喷雾电压5500V；离子源温度550℃。MRM监测离子对、去簇电压（DP）、碰撞电压（CE）见表1。
表14种兽药检测的最优质谱条件Table1OptimizedMRMconditionsforfourveterinarydrugs
注：*表示定量离子。
待测物母离子子离子去簇电压/V碰撞电压/VCAP320.8151.8*-80-17256.8-25CAP-d5326.1156.9-80-25SEM209.2192.16017166.3*16AOZ236.1104.16632133.9*19AHD249.1104.06631134.1*19AMOZ335.2262.27425291.3*19SEM-13C15N2212.2168.26015AOZ-D4240.1134.16619AHD-13C3252.0134.16619AMOZ340.1296.17419MG329.2208.111147313.2*48LMG331.2239.1*11142316.230MG-D5334.2318.211149LMG-D6337.3240.110641ENR360.1342.17525316.2*35ENR-D5365.0321.27529
依据农业部公告235号、560号。
以阴性样品作为测试样品，在检出限浓度、2倍检出限浓度、5倍检出限浓度3个水平上进行添加回收试验，并按照上述方法进行提取、净化和测定，在相同条件下每个水平作6个平行样，所得到的回收率和相对标准偏差见表3。
表24种兽药的线性方程及检出限、定量限Table2Linearequations，LODandLOQforfourveterinarydrugs
表34种兽药加标回收率和相对标准偏差Table3RecoveriesandRSDforfourveterinarydrugs
待测物添加浓度/（μg/kg）平均测定值/（μg/kg）平均回收率/%RSD/%CAP0.050.03672.01.10.10.08887.61.70.250.20180.32.9SEM0.50.43086.16.91.00.80180.110.12.01.73286.66.6AOZ0.50.41282.48.11.00.90290.28.92.01.72286.16.7AHD0.50.42084.16.61.00.85885.89.32.01.82091.07.1
续表34种兽药加标回收率和相对标准偏差Continuetable3RecoveriesandRSDforfourveterinarydrugs
待测物添加浓度/（μg/kg）平均测定值/（μg/kg）平均回收率/%RSD/%AMOZ0.50.45791.47.91.00.89089.04.92.01.64882.49.1MG0.20.213106.42.70.40.410102.62.81.01.030103.02.4LMG0.20.19195.62.60.40.38997.22.71.01.003100.32.5ENR0.50.40280.42.331.00.89789.710.12.51.89075.68.0
表42017年4种兽药残留的检出情况Table4Detectionoffourveterinarydrugsin2017
药物标准限量/（μg/kg）样品数检出范围/（μg/kg）均值/（μg/kg）检出数检出率/%超标数超标率/%氯霉素不得检出65＜0.1＜0.10000硝基呋喃类代谢物不得检出65＜0.1～1.681.2323.0823.08孔雀石绿不得检出121＜0.5～621.673.097.4497.44恩诺沙星10056＜1.0～294.228.74987.523.57
表5不同月份孔雀石绿检出情况Table5Detectionofmalachitegreenindifferentmonth
月份样品数检出范围/（μg/kg）均值/（μg/kg）检出数检出率/%33NDND0044NDND00510NDND00
续表5不同月份孔雀石绿检出情况Continuetable5Detectionofmalachitegreenindifferentmonth
注：ND表示未检出。
月份样品数检出范围/（μg/kg）均值/（μg/kg）检出数检出率/%611ND～1.921.9219.108431.2～621.693.4716.289291.51.513.451121NDND00
不同月份孔雀石绿检出情况见表5。
从表5看出，在3月～5月和11月的38份（占样品总数的31.40%）样品中未检测到孔雀石绿；6月和9月的检出率分别为9.10%（1/11）和3.45%（1/29），最高检出值为1.92μg/kg；8月检出率高达16.28%（7/43），最高检出值高达621.6μg/kg，其余检出值均低于15.6μg/kg。
共采集9种淡水鱼样品119份，沼虾和罗氏虾各1份。其中有6种鱼检出孔雀石绿，说明孔雀石绿在淡水鱼的养殖中使用范围仍较广。鳙鱼检出率最高，达25.00%（1/4），黄颡鱼其次，达16.67%（3/18），鳊鱼和罗非鱼检出率均为12.50%（1/8），黑鱼检出率为7.14%（1/14），鲫鱼检出率为6.06%（2/33）。黄颡鱼是徐州市场上常见的淡水鱼，其检出率较高，与其主要疾病（黄颡鱼红头病、黄颡鱼细菌性烂鳃病、肠炎病和车轮虫病）均在4月～7月间流行相吻合[7]，具体见表6。
表6不同水产品中孔雀石绿检出情况Table6Detectionofmalachitegreenindifferentspeciesofaquaticproducts
种类样品数阳性样品数阳性率/%鲫鱼3326.06鲤鱼2200黄颡鱼18316.67黑鱼1417.14鳊鱼8112.5罗非鱼8112.5加州鲈鱼700草鱼500鳙鱼4125虾200
在4月～9月共采集9种活鱼样品56份（鲫鱼14份，鲤鱼10份，黄颡鱼9份，黑鱼9份，罗非鱼3份，鳊鱼3份，加州鲈鱼3份，鲶鱼3份，鲢鱼3份），9种鱼均检出恩诺沙星，说明恩诺沙星在水产养殖中广泛使用。4月没有检出，5月检出率为71.43%，6月检出率为80.0%，8月～9月检出率高达95%以上，说明在水产养殖中几乎都使用恩诺沙星防治疾病，尤其是在水温较高季节，见表7。
表7不同月份恩诺沙星检出情况Table7Detectionofenrofloxacinindifferentmonth
月份样品数检出范围/（μg/kg）均值/（μg/kg）检出数检出率/%42NDND0057ND～154.625.24571.4365ND～206.96480.0840ND～294.227.593895.0921.7～89.545.62100.0
在对草鱼体内恩诺沙星及其代谢物的残留消除规律进行试验研究，发现22d后草鱼体内恩诺沙星及其代谢物残留量消除至100μg/kg以下，49d后则检测不到目标物质（检测低限6μg/kg）。本次调查检测超标率只有3.57%，说明大部分养殖户能够严格遵守休药期的规定。
研究建立水产品中氯霉素、硝基呋喃类及其代谢物、孔雀石绿和恩诺沙星等4种兽药残留的LC-MS/MS检测方法。4种方法定量限在0.1μg/kg～1μg/kg，回收率范围在72%～106.4%之间，相对标准偏差均小于10.1，所建立的方法能够满足检测水产品中上述4种兽药残留的需要。
恩诺沙星是喹诺酮类化合物第三代产品-氟喹诺酮类药物的一种，大量研究结果证实恩诺沙星具有高度的抗菌活性，几乎对嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、弧菌、链球菌、巴德氏菌、爱德华氏菌等水生动物所有的病原菌都表现出较强的抗菌作用[10]。喹诺酮类药物具有对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有效，尤其是对革兰氏阴性菌作用强的特点，水生动物细菌性疾病大多为革兰氏阴性菌，表明恩诺沙星适合水生动物细菌性疾病的防治。
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DeterminationandAnalysisofVeterinaryDrugResidueinFreshFishandShrimpSoldinSomeCity
SONGYang-wei，WANGYun-fei，ZHAOXuan，FANGChao，SUNHui-yu（XuzhouEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau，Xuzhou221000，Jiangsu，China）
Abstract：Methodsfor4veterinarydrugsresidueinaquaticproductswereestablished，aquaticproductsonmarketweredeterminedforfoodsafetysupervision.Atotalof121freshfishandshrimpwerecollectedRandomly，theresiduesofchloramphenicol，nitrofurans，malachitegreenandenrofloxacinweredetermined.Thequalifiedrateoffreshfishandshrimpwas89.26%；Chloramphenicolwasnotdeterminedinbannedveterinarydrugs，nitrofuransandmalachitegreenweredeterminedbydifferentdegrees，thedetectionrateofmalachitegreenwashigheranditwas7.44%（9/121），thehighestdetectionvaluewas621.6μg/kg；Thedetectionrateofenrofloxacinwas87.5%（49/56）inlimiteddrugs，buttherateofexceedwasonly3.57%（2/56）.Afteryesrsofcontrol，itwashardtodetecttheresidueofchloramphenicolandnitrofurans，enrofloxacinhadthelowerstandardexceedingratio，butthecheapandeffectivemalachitegreenwasstilldetermined，anditwasnecessarytostrengthenthemonitoringandmanagement.
Keywords：soldinsomecity；fishandshrimp；veterinarydrugsresidue；determination；analysis
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2019.05.037
基金项目：徐州市科技公共服务平台建设项目（KC16JP205）
作者简介：宋阳威（1978—），男（汉），高级兽医师，本科，研究方向：动物产品质量与安全。
引文格式：
宋阳威，王云飞，赵轩，等.市售鲜活鱼虾中兽药残留检测与分析[J].食品研究与开发，2019，40（5）：203-208
SONGYangwei，WANGYunfei，ZHAOXuan，etal.DeterminationandAnalysisofVeterinaryDrugResidueinFreshFishandShrimpSoldinSomeCity[J].FoodResearchandDevelopment，2019，40（5）：203-208