宋亚宁1,胡超琼1,霍秋宇1,王力均1,2,陈祥贵1,2,黄玉坤1,2*
1(西华大学食品与生物工程学院,四川成都,610039)2(宜宾西华大学研究院,食品非热加工重点实验室,食品非热加工工程技术研究中心,四川宜宾,644004)
培氟沙星(pefloxacin,PEF)是一类人工合成的氟喹诺酮类抗生素,对阴性菌和阳性菌表现出抗菌活性[1],常应用于渔业、畜牧业等[2],当其含量超过阈值时,会对人体健康造成危害[1-3]。2015年9月,我国农业农村部发布公告停止食品动物中使用PEF、洛美沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种兽药[4]。目前,针对PEF等氟喹诺酮类兽药残留的检测方法主要有微生物法[5]、免疫分析法[6-8]、色谱法[9-10]、色谱-质谱联用法[11-13]以及其他新型检测方法等[14-17]。但这些方法存在灵敏度低、特异性差、设备昂贵、样品预处理复杂且检测费时、成本高等缺陷,不能较好地满足现场快速检测样品的要求[18-19]。因此,建立高效、快速及可靠的检测方法,不仅有利于减少检测成本,也可满足动物食品现场快速检测的需求。
Y(NO3)3·6H2O、Ce(NO3)3·6H2O、Tb(NO3)3·5H2O、环丙沙星、达氟沙星、亲和素、氨苄青霉素钠盐,西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；O-磷酸乙醇胺(O-phosphorylethanolamine,AEP),梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；氯金酸、PEF、恩诺沙星,上海市阿拉丁生化科技股份有限公司；乙二醇、戊二醛水溶液(体积分数25%)、NaCl等,国药集团化学试剂有限公司(中国上海)；磺胺甲恶唑,华夏化学试剂有限公司；农业硫酸链霉素,石家庄通泰生化总厂；纯牛奶,本地超市。
PEF适配体序列参考REINEMANN等[31]的报道,为5′-biotin-ATACCAGCTTATTCAATTAGTTGTGTATTGAGGTTTGATCTAGGCATAGTCAACAGAGCAC-GATCGATCTGGCTTGTTCTACAATCGTAATCAGTTAG-3′；PEF适配体及互补链(complementarydeoxyribonucleicacid,cDNA)序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
激光粒度仪(ZSN3600),英国马尔文仪器有限公司；荧光光谱仪(FLUOROMAX-4CP),美国HORIBA公司；双束紫外分光光度计(SDPTOPUV2800PC),上海舜宇恒平科学仪器有限公司；小型高速离心机(5424),德国Eppendorf股份公司；真空干燥箱(BZF-50),上海博讯实业有限公司；纯水/超纯水一体机(Direct-Q),美国Millipore公司；水热合成反应釜(YH-50),上海越众仪器设备有限公司。
1.3.1适配体与靶标PEF分子对接分析
根据ZYKER[32]的方法,使用基于web服务器Mfold工具、3dRNA工具、AutoDock软件和DiscoveryStudio软件进行分子对接分析,从而确定适配体互补链cDNA的序列。
1.3.2制备NaYF4:Ce/Tb纳米颗粒
参考TU等[33]方法合成NaYF4:Ce/Tb的纳米材料。在圆底烧瓶中加入1.0mmolAEP及一定化学计量比的NaCl、Y(NO3)3·6H2O、Ce(NO3)3·6H2O和Tb(NO3)3·5H2O,并与含有适量NH4F的乙二醇溶液溶解后老化30min,转移至高压反应釜于180℃反应4h,取出自然冷却至室温。洗涤后于60℃真空干燥箱干燥10h,固体颗粒室温避光封闭保存。
1.3.3亲和素修饰NaYF4:Ce/Tb纳米颗粒的制备
利用经典戊二醛法偶联亲和素与NaYF4:Ce/Tb表面的氨基[34]。称取一定量纳米颗粒分散于磷酸缓冲液(phosphatebufferedsaline,PBS)中与适量戊二醛水溶液反应,洗涤后加入一定量亲和素于37℃连续过夜,反应后用PBS洗涤3次。最后重悬于PBS中,4℃保存备用。
1.3.4组装Apt-NaYF4:Ce/Tb纳米颗粒
将定量的适配体加入亲和素化纳米颗粒悬浮液中,于37℃缓慢振荡孵育3h,反应结束后用PBS离心洗涤3次,重悬于PBS中,4℃保存备用。
1.3.5制备纳米金
将氯金酸溶液和超纯水加入圆底烧瓶进行磁力搅拌煮沸,加入4mL柠檬酸钠。反应保持沸腾持续搅拌20min,得到酒红色溶液,冷却后待用。
1.3.6构建基于TR-FRET检测PEF的方法
1.3.7基于TR-FRET检测PEF测定牛奶样品中PEF
将此检测方法应用于实际食品样品中PEF的定量检测,并对此方法的分析性能进行探索。牛奶样品处理具体步骤如下：将PEF标准品用纯牛奶进行溶解,在室温4000×g离心20min,去除牛奶样品的上层脂肪层,将加标的牛奶样品用结合缓冲液进行10倍稀释,加以空白对照。
根据步骤1.3.1描述的工具模拟获得PEF适配体的二级预测结构(图2-a)。利用AutoDock、DiscoveryStudio软件对适配体和PEF进行分子对接,其关键结合位点如图2-b所示,主要集中在适配体的茎环及长茎区域(图2-a红框示意)。因此根据碱基互补配对原理,设计得到适配体互补链cDNA序列为5′-TTACGATTGTAGA-3′。
图2适配体二级结构预测图(a)与适配体与PEF分子对接示意图(b)Fig.2Secondarystructurepredictiondiagramofaptamer(a)anddockingdiagramofaptamerwithPEFmolecular(b)
TRF纳米材料与纳米金因适配体与cDNA的互补配对而拉近,发生荧光共振能量转移,导致荧光淬灭,加入靶标PEF后荧光恢复,从而完成PEF目标物质的检测,因此,本实验条件优化主要针对纳米金与互补链比例以及适配体与互补链比例,结果如图4-a所示。当cDNA∶纳米金为150∶1时,NaYF4∶Ce/Tb的荧光强度在543nm处的荧光减弱,淬灭效果最优且趋于稳定,因此选择cDNA∶纳米金最佳比例为150∶1。图4-b表明,当cDNA加入量为140pmol时荧光淬灭最强,选择探针组装最佳用量为140pmol。但随着cDNA浓度逐渐增大,荧光强度呈现先上升后又下降的趋势,原因可能是反应体系后期受到纳米金表面空间条件的限制,过量的cDNA会直接与适配体
碱基互补配对结合而导致荧光强度又降低。
a-cDNA与纳米金比例优化;b-适配体与互补链比例优化图4实验条件优化Fig.4Optimizationofexperimentalconditions
基于适配体特异性结合靶标PEF的特点,选取PEF及其他6种抗生素(质量浓度均为1mg/mL),包括磺胺甲恶唑、农用硫酸链霉素、氨苄青霉素钠、环丙沙星、达氟沙星和恩诺沙星,离心取上清液测定其荧光强度,判断建立的基于TRF结合纳米金法检测PEF的特异性。实验结果如图5所示,在相同浓度下,7种抗生素所引起的荧光强度的变化明显不同,其中PEF的相对荧光强度远高于磺胺甲恶唑、农用硫酸链霉素和氨苄青霉素钠的强度。如果设定PEF响应值为100%,则PEF的同属氟喹诺酮类兽药环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星的相对荧光强度分别为PEF的9.73%、12.57%和12.71%,相较于PEF,环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星引起的荧光信号变化较小,基本可以忽略。实验结果表明本方法选择性良好,可应用于实际检测。
图5本方法特异性分析Fig.5Specificityanalysisofthepresentdetection
a-PEF不同添加量体系的荧光强度;b-测定PEF的工作曲线图6建立检测PEF的标准曲线Fig.6EstablishmentofstandardcurvefordetectionofPEF
为验证本方法在实际样品中应用的准确性,将此法用于检测牛奶样品中的PEF。采用步骤1.3.7进行样品预处理后,向牛奶样品中分别加入1、5、15μg/kg的PEF标准品液,每个添加量平行样品测定3次。实验结果如表2所示,PEF加标回收率在73.81%～99.86%,表明本法检测牛奶中PEF准确性较好,可应用于实际样品的测定。
表1牛奶中PEF的加标回收测定结果Table2RecoveryofPEFaddedinmilk
样品基质PEF质量浓度/(μg·kg-1)PEF加标质量浓度/(μg·kg-1)PEF测定质量浓度/(μg·kg-1)回收率/%010.897±0.06489.70±0.06454.993±0.07699.86±0.0761511.072±0.10373.81±0.103
本方法构建的PEF检测体系得到的PEF检测限为0.15μg/kg,线性范围为0.2～20μg/kg,测得牛奶中PEF残留加标回收率为73.81%～99.86%。与表2中其他方法相比,本方法具有线性范围较宽、检测灵敏度较高的特点。同时,基于此研究基础上,可以拓宽至建立多种靶标同时检测的体系,达到现场低成本快速检测的目标,可以更加有效地应用于食品中兽药残留检测。
表2常见检测PEF的方法Table2CommonmethodsforthedetectionofPEF
样品检测方法检测限/(μg·kg-1)线性范围/(μg·kg-1)参考文献鸡蛋液相色谱-串联质谱2-[35]水产品胶体金免疫技术4-[36]-酶联免疫吸附法0.10.2-376[37]牛奶可视化蛋白芯片法0.020.1-9[38]
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AbstractPefloxacin(PEF)iswidelyusedinthepreventionandtreatmentoflivestockandpoultrydiseases,whichisfrequentlycausingveterinarydrugresiduesinfoodandthusaffectinghumanhealth.Therefore,itisnecessarytoconstructaneffectiveandrapiddetectionmethodforPEF.NaYF4:Ce/Tbnanomaterialwithtime-resolvedfluorescencepropertieswassynthesizedbyusingthesolventhotmethodinthisstudy.Simultaneously,complementarystrand(cDNA)ofPEFaptamerwasdesignedbycomputeraidedmoleculardocking.GoldnanoparticlesandluminescentnanomaterialsweremodifiedontoaptamerandcDNArespectively.Therebytime-resolvedfluorescenceresonanceenergytransfer(TR-FRET)betweenthesetwonanomaterialswasinducedincaseofcomplementarybasepairing.Basedonthisprinciple,thenoveldetectionmethodofPEFinmilkwasconstructed.Undertheoptimalexperimentalconditions,thelinearrangeofdetectionwas0.2-20μ/kg(y=1567.3x+3956.3,R2=0.9742).Therecoveryrateswere73.81%-99.86%.TheseresultsshowedthatthepresentmethodcanbeappliedinthedetectionofPEFinthepracticalmilksample.
Keywordspefloxacin;time-resolvedfluorescence;aptamer;milk
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.025869
第一作者：硕士研究生(黄玉坤副教授为通讯作者,E-mail:hyk_diana@163.com)
基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目(31801647)；四川省科技厅项目(2020YFN0151,2020YFN0153)；西华大学创新训练项目(201710623035);西华大学“西华杯”大学生创新创业项目(2021128)