犬细小病毒/犬瘟热病毒(CPV/CDV)核酸检测试剂盒(双重荧光PCR法)

本试剂盒根据荧光PCR技术原理，针对PCR试剂盒设计特异性引物和Taqman探针，通过荧光PCR检测仪进行检测，从而实现对PCR试剂盒的检测。

【储存条件及有效期】

1．避光-20℃储存，有效期12个月。

2．低温运输不能超过4天；开封后避光-20℃储存，对有效期没有影响。避免反复冻融，冻融6次不影响检测效果。

3．生产日期、有效期至：见外包装盒。

【适用仪器】

适用于ABI7500、Bio-RadCFX96、Roche480等全自动荧光PCR检测仪。

【样本要求】

1．样本种类：鼻/咽拭子、痰液、支气管肺泡灌洗液；培养物等样品。

2．保存条件：采集的标本应及时送检，24小时内检测的应4℃保存，超过24小时的最好-70℃保存，并避免反复冻融。

【检测方法】

1．试剂准备（试剂准备区）

将试剂盒各组分置4℃避光融化，充分混匀后瞬间离心。计算试剂使用份数N（N=样本数+1管阳性对照+1管阴性对照），根据下表配置反应体系mix，加入一适当体积离心管中，充分混匀后瞬间离心，按20μL分装至PCR反应管/板，并转移至样本处理区。

组分

体积（μL）

qPCR预混液（含酶）

16

引物探针

4

总体积（反应体系mix）

20

2．样本处理（样本处理区）

①核酸提取

选择合适的核酸提取试剂盒提取核酸，具体按照相应的试剂盒说明书操作。

②加样

在已加入反应体系mix的PCR反应管/板上分别加入处理好的待检标本核酸、阴性对照、阳性对照各5μL，终体积为25μL。

盖紧管盖或封膜，瞬间低速离心后置荧光PCR检测仪扩增。

3．扩增检测（核酸扩增区）

步骤

温度

循环数

①预变性

95℃

5min

1cycle

②变性

退火/延伸/检测荧光*

55℃

10s

40s

40cycles

*步骤②中55℃时荧光检测，检测通道为FAM。*ABI系列荧光PCR仪不选ROX校正，淬灭基团选None。

4．结果分析根据分析后图像调节起止值，（建议起始设在3～15、终止设在5～20，同时调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线），点击分析，在报告界面查看结果。

【质量控制】

1．阴性对照：Ct值＞38或未检出。

2．阳性对照：扩增曲线呈S型，且Ct值≤30。

3．同一实验以上要求需同时满足，否则本次实验视为无效。

4．每种检测靶标都需设阴阳对照，不同的靶标根据对应阴性调整基线阈值。

【结果判读】

1．FAM通道检测B组链球菌。

2．阴性：Ct值＞38或未检出。

3．阳性：扩增曲线呈S型，且Ct值≤35。

4．可疑：扩增曲线呈S型，且35＜Ct值≤38，需复检；复检结果若一致，判定结果为阳性。

【检验方法的局限性】

1．样品采集、运输、保存不当，试剂运输、保存、配置不当都可能会影响实验结果，甚至会导致假阴性结果。

2．如果实验室污染、试剂污染、样品交叉污染，可能出现假阳性结果。