探讨鼠李糖乳酸杆菌GKLC1(LacticaseibacillusrhamnosusGKLC1)对胃部保护的作用
邱婕宁1，蔡侑珊1，林珊1，陈嘉琪2，林诗伟1，林静敏3，陈炎炼1，陈劲初4,5,6*
1葡萄王生技股份有限公司，台湾桃园
2动物科技研究所，农业科技研究院，台湾苗栗
3上海葡萄王企业有限公司，上海
4台湾大学食品科技研究所，台湾台北
5实践大学食品营养与保健生技系，台湾台北
6中原大学生物科技学系，台湾桃园
收稿日期：2023年11月17日；录用日期：2024年4月11日；发布日期：2024年4月19日
摘要
过去研究团队于酒精引起之肝损伤动物试验中，观察到益生菌(probiotics)鼠李糖乳酸杆菌GKLC1(LacticaseibacillusrhamnosusGKLC1)不仅具护肝效果，同时在该模式下观察到受酒精影响损伤的胃部组织获保护的效果。因此进一步地，本研究探讨益生菌GKLC1对胃部的保健功效。针对幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori)引起的胃溃疡(gastriculcer)，以体外试验琼脂纸锭扩散法(agardiskdiffusiontest)测试益生菌GKLC1对于三种不同株H.pylori的抑制效果。针对非类固醇消炎药(non-steroidalanti-inflammatorydrugs,NSAIDs)引起的胃溃疡，则以ICR小鼠连续摄入10天阿斯匹林(500mg/kg/dayAspirin)诱发胃损伤，评估益生菌GKLC1(高剂量：20.4mg/kg/day；低剂量：5.12mg/kg/day)预先补充对胃保护的效果。结果益生菌GKLC1对于标准病原株H.pylori26695或临床分离的抗药病原株H.pyloriv633、H.pyloriv1354皆无抑制表现；然而经Aspirin诱导的胃溃疡，益生菌GKLC1则可显著减少胃溃疡的面积、胃黏膜溃疡深度、以及增加胃溃疡治愈力。综合以上结果，L.rhamnosusGKLC1对于胃部机能具保护功效，特别是饮食、药物引起的伤胃保护，对于微生物引起的胃病则较无效果。
关键词
胃溃疡，幽门螺旋杆菌，非类固醇消炎药，益生菌，胃保护
ToExploretheProtectiveEffectsofLacticaseibacillusrhamnosusGKLC1ontheStomach
Chieh-NingChiu1,You-ShanTsai1,ShanLin1,Chia-ChiChen2,Shih-WenLin1,Jing-MinLin3,Yen-LienChen1,Chin-ChuChen4,5,6*
1GrapeKingBioCo.Ltd.,TaoyuanTaiwan
2AnimalTechnologyResearchCenter,AgriculturalTechnologyResearchInstitute,MiaoliTaiwan
3ShanghaiGrapeKingEnterpriseCo.Ltd.,Shanghai
4InstituteofFoodScienceandTechnology,NationalTaiwanUniversity,TaipeiTaiwan
5DepartmentofFoodScience,NutritionandNutraceuticalBiotechnology,ShihChienUniversity,TaipeiTaiwan
6DepartmentofBioscienceTechnology,ChungYuanChristianUniversity,TaoyuanTaiwan
Received:Nov.17th,2023;accepted:Apr.11th,2024;published:Apr.19th,2024
ABSTRACT
Keywords:GastricUlcer(GU),Helicobacterpylori,Non-SteroidalAnti-InflammatoryDrugs(NSAIDs),Probiotics,GastricProtection
ThisworkislicensedundertheCreativeCommonsAttributionInternationalLicense(CCBY4.0).
1.引言
鼠李糖乳酸杆菌GKLC1(Lacticaseibacillusrhamnosus，旧名Lactobacillusrhamnosus)在胃酸耐受性试验中具有80%以上的存活率[11]，且已经证实益生菌(probiotics)的潜力，对人体的机能性功效包含肾脏保护、肝脏保护等[12][13]。在先前的一项研究指出，菌株GKLC1可缓解酒精诱发酒精性脂肪肝疾病(alcoholicfattyliver)小鼠的肠胃道损伤[13]；因此本研究将进一步探讨鼠李糖乳酸杆菌GKLC1对于胃部保护的作用。分别以临床常见的病原微生物以及NSAIDs引起的胃溃疡探讨益生菌菌株GKLC1的保护效果。
2.材料与方法
鼠李糖乳酸杆菌(Lacticaseibacillusrhamnosus)菌株GKLC1分离自台湾妇女母奶，并寄存于台湾食品工业发展研究所生物资源中心(BioresourceCollectionandResearchCenter,BCRC,Taiwan)，寄存编号为BCRC910988。试验用菌株GKLC1的制备来自挑取单一菌落培养于MRS肉汤培养基(BD,USA)中，经37℃、16小时活化培养2次后，接种3ml于5L发酵槽(发酵体积3L)中，以37℃、16小时培养。量化培养后之发酵液以13,000rpm于4℃离心10分钟，收取上清液以121℃热处理3分钟，供体外试验用。另外收取上述离心之菌泥(pellet)，并混入5%脱脂奶粉，经冷冻干燥后取得菌株GKLC1粉末样品。每克粉末含有活菌数1×1011CFU(conloyformingunit)，并保存于4℃供动物试验使用。
胃幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori)菌株26695(ATCC700392)、v633、v1354皆由台湾长庚大学(ChangGungUniversity,Taiwan)赖志河老师提供。其中抗药菌株v633、v1354为临床分离株，经证实皆对抗生素甲硝唑(metronidazole)和克拉霉素(clarithromycin)具抗药性[14]。H.pylori于37℃、5%CO2与10%O2供给下，48小时培养于含10%羊血之布鲁氏琼脂(Brucellabloodagar)平板中。
2.3.琼脂纸锭扩散试验(DiskDiffusionTest)
将H.pylori悬浮液(1×108CFU/ml)涂抹于10%羊血的M-H培养基平板(MuellerHintonagarplates,BBL,Sparks,Maryland,USA)上，并于平板中央放上灭菌纸锭，随后于纸锭上加入测试之菌株GKLC1发酵上清液。平板于37℃、微需氧环境下，培养72小时后，观察抑制圈(inhibitionzone)大小，并以直径(mm)纪录之。试验以未接菌的MRS肉汤培养基为空白对照组(control)；L.rhamnosusGG(ATCC53103)为阳性对照组(positivecontrol)。
2.4.试验动物
试验动物使用8周龄SPF级ICR雄鼠共25只，购自乐斯科生物科技股份公司(BioLASCOTaiwanCo.Ltd.,Taiwan)，小鼠进驻后皆先行观察5天，确认无任何异状后，才进行试验分组与试验执行。动物房条件控制在温度23℃±2℃、湿度55%±5%、以及光/暗周期12h/12h。饲料及逆渗透水均任由小鼠自由取用。本试验之试验小鼠经台湾农业科技研究院(AgricultureTechnologyResearchInstitute,ATRI)之实验动物照护及使用委员会(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee,IACUC)审查同意，取得IACUC号码110075。
2.5.NSAIDs引起GU之试验设计
以随机方式分为5组，每组5只小鼠，分别为正常对照组(Normalcontrol,Normal)、负对照组(Gastriculcer,GU)、奥美拉唑组(Omeprazole)及2组益生菌实验组GKLC1-L、GKLC1-H组。试验时，Normal组、GU组每日管喂投予饮用水；Omeprazole组每日管喂投予10mg/kg胃溃疡临床治疗用药奥美拉唑(Omeprazole)；实验组GKLC1-L、GKLC1-H组每日管喂投予益生菌GKLC1粉末，投予剂量分别为5.12mg/kg/day及20.4mg/kg/day。给予Omeprazole或益生菌28天后，除Normal组外，各组皆于第29天连续10天每日管喂阿司匹林(Aspirin)500mg/kg诱发胃溃疡，于第40天牺牲，观察小鼠的胃部溃疡情形及组织病理变化。
2.6.GU胃部状态分析
Table1.Ulcerareascore
2.7.GU組織病理分析
Table2.Gradingofgastriculcertissuelesions
2.8.统计分析
本试验所得数据以平均值±标准偏差(mean±SD)表示，使用GraphpadPrism6统计分析软件，进行one-wayanalysisofvariance(one-wayANOVA)分析，以p<0.05具有统计上的显著性差异。在病理结果统计上，比较各组别间组织病变严重度则以Kruskal-Wallistest的UncorrectedDunn’s事后检定。
3.结果
3.1.菌株GKLC1对于H.pylori的抑制效果
Table3.Inhibitionzone(mm)ofL.rhamnosusagainstdifferentH.pyloristrains
数据(n=3)以mean±SD呈现。
Figure1.TheinhibitioneffectofstrainGKLC1onH.pylori26695
3.2.菌株GKLC1对NSAIDs引起的GU
3.2.1.GU小鼠胃溃疡面积
数据(n=5)以mean±SD呈现。
Figure2.Bodyweightchange(g)inGUmicemodel
数据(n=5)以mean±SD呈现。不同字母表示具显着差异。
Figure3.Areaofgastriculcer(mm2)inmice
3.2.2.GU小鼠胃溃疡指数与治愈率
Table4.Ulcerindexandcurativeratio
3.3.NSAIDs引起的GU胃部病理分析
Figure4.MorphologicalchangesingastrictissueofGUmice;(a)Normal;(b)Gastriculcer(GU);(c)Omeprazole;(d)LowdoseofstrainGKLC1(GKLC1-L);(e)HighdoseofstrainGKLC1(GKLC1-H).H&Estaining,100×magnification.(Redasterisk:areaofdegenerationandnecrosisofmucosalepithelialcells)
Table5.HistopathologicalScore
数据(n=4)以mean±SD呈现。不同字母表示具显着差异。
4.讨论
排除消化道病变严重需要施行手术之外，消化性溃疡大多系经由药物治疗，透过减少或中和胃酸分泌、增加消化道屏障以达治愈目的[17]。Omeprazole为氢离子帮浦阻断剂(protonpumpinhibitors,PPIs)，可在胃的壁细胞转变成活化态，绑定氢/钾三磷酸腺苷酶(H+/K+-ATPase)，减少胃酸分泌，进而减少溃疡发生、加速胃壁愈合，因此已广泛使用在治疗胃食道逆流(gastroesophagealreflux)、PUD等胃部疾病[18]。然而其缺点除了药价贵以外，长期使用可能造成无胃酸症(hypochlorhydria)的副作用，当无胃酸屏障时，胃部受感染的机会提升；此外PPI经肝脏代谢，对于合并肝病的患者是一负担；近期亦有其他研究指出PPIs可增加骨折、低血镁症(hypomagnesemia)、以及肾损伤等风险[19]。
益生菌可藉由不同方式保护肠胃道，因此不像PPIs仅针对胃酸分泌做调控，更是以生理系统性调控的方式改善胃部机能[20]。例如嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)能透过减少发炎物质COX-2与TNF-α，并抑制NF-B讯息传递，改善胃发炎[21]；植物乳杆菌(L.plantarum)299v可刺激MUC3基因分泌黏液素，保护胃黏膜并减少病原菌附着[22]；L.rhamnosusGG对胃黏膜及肠道定殖力佳，可透过调控表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)及血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)，减弱细胞凋亡与细胞增值比率、增加血管生成提升胃壁愈合能力，减少溃疡复发率[23]。
5.结论
本试验以常见胃溃疡诱因探讨LacticaseibacillusrhamnosusGKLC1对于胃部保护的效果。结果显示菌株GKLC1对胃幽门螺旋杆菌引起的胃溃疡较无保护的效果，然而针对非类固醇消炎药引起的胃溃疡则有显著护胃的功效。此外，在小鼠施予益生菌GKLC1高剂量(20.4mg/kg/day)下，其NSAIDs的胃溃疡治愈效果相当于市售常见胃药Omeprazole(10mg/kg/day)。本篇经实验证实护胃的机能益生菌与其适应症，未来可考虑应用菌株GKLC1以保健预防方式，减少因NSAIDs引起胃溃疡的族群，或以合并治疗方式针对NSAIDs引起的胃溃疡做处置，进而降低常见胃药使用所带来的副作用。