1、药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)前言药物体内代谢、转运及药物作用靶点基因的遗传变异及其表达水平的变化可通过影响药物的体内浓度和敏感性，导致药物反应性个体差异。近年来随着人类基因组学的发展，药物基因组学领域得到了迅猛发展，越来越多的药物基因组生物标记物及其检测方法相继涌现。药物基因组学已成为指导临床个体化用药、评估严重药物不良反应发生风险、指导新药研发和评价新药的重要工具，部分上市的新药仅限于特定基因型的适应症患者。美国FDA已批准在140余种药物的药品标签中增加药物基因组信息，涉及的药物基因组生物标记物42个。此外，部分行业指南也将部分非FDA批准的生物标记物及其特性（如MGM
3、药剂量，实现个体化用药，从而提高药物治疗的有效性和安全性，防止严重药物不良反应的发生。目前美国FDA和我国食品药品监督管理局（CFDA）都已批准了一系列的个体化用药基因诊断试剂盒。这些试剂盒基本都是对人DNA样本进行基因检测。而在基因表达的检测方面，由于RNA的稳定性差，样本处置不当可导致目标RNA降解，使得检测结果不准确，影响临床判断。因此，RNA检测试剂的研发相对滞后。本指南旨在为个体化用药基因检测提供一致性的方法。本指南中所指的药物基因组生物标志物不包括影响抗感染药物反应性的微生物基因组变异。此外，肿瘤靶向治疗药物个体化医学检测指南见肿瘤个体化治疗的检测技术指南。本指南起草单位：中南大学
4、湘雅医院临床药理研究所、中南大学临床药理研究所、中南大学湘雅医学检验所，并经国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会、中国药理学会药物基因组学专业委员会、中国药理学会临床药理学专业委员会和中华医学会检验分会组织修订。本指南起草人：周宏灏、陈小平、张伟、刘昭前、尹继业、李智、李曦、唐洁、俞竞、彭静波、曹杉、成瑜。目录1.本指南适用范围12.药物代谢酶和药物作用靶点基因检测概述13.标准术语14.药物代谢酶和药物作用靶点基因检测分析前质量保证64.1采样前准备64.2标本采集74.3标本的运输与保存94.4标本的接收与保存95.药物代谢酶和药物作用靶点基因检测分析中质量保证105.1实验室设
6、2551.本指南适用范围本指南由国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会制定，旨在为临床检验实验室进行药物代谢酶和药物靶点基因的检测提供指导。本指南的主要适用对象为开展个体化医学分子检测的医疗机构临床实验室。2.药物代谢酶和药物作用靶点基因检测概述药物代谢酶和药物作用靶点基因特性的变化可通过影响药物的体内浓度和靶组织对药物的敏感性，导致药物反应性（包括药物的疗效和不良反应发生）个体差异。药物基因组生物标志物的检测是临床实施个体化药物治疗的前提。从药物代谢酶和药物作用靶点基因出发，对个体化用药基因检测的适应人群、标本采集、运输、接收、处理、样本检测、结果报告与解释、室内室间质控需遵循的基本
7、原则，以及可能出现的问题与应对措施等方面的内容进行介绍，可为基于药物代谢酶和药物作用靶点的基因检测提供标准化指导。3.标准术语3.1Ct值（thresholdcycle）荧光定量PCR反应的荧光强度超过设定的阈值所需的循环数。Ct值位于PCR反应的指数期初期，与标本中待测核酸分子的原始拷贝数呈反比，即样本中原始拷贝数越多，荧光强度升高的就越快，相应的Ct值就越小。3.2RNA（ribonucleicacid）核糖核酸，与DNA类似的单链核酸，由核糖核苷酸按照一定的顺序排列而成，含尿嘧啶而不含胸腺嘧啶，存在于细胞质和细胞核中，在细胞蛋白质的合成及其他化学活动中起重要的作用。RNA分子包
8、含信使RNA（mRNA）、转运RNA（tRNA）、核糖体RNA（rRNA）和其他小RNA等多种类型，分别行使不同的功能。各种RNA的混合物称为总RNA。3.3rs和ss体系SNP由美国国立生物技术信息中心（nationalcenterforbiotechnologyinformation，NCBI）建立、dbSNP数据库制定的SNP命名体系，rs体系的SNP代表已获得官方认可和推荐的参考SNP（referenceSNP），ss体系的SNP代表用户新递交但尚未得到认可的SNP（submittedSNP）。3.4TE缓冲液TE缓冲液由Tris和EDTA配置而成，主要用于溶解DNA
9、，能稳定储存DNA。3.5错配修复（mismatchrepair，MMR）在含有错配碱基的DNA分子中，使正常核苷酸序列恢复的核甘酸修复方式，这种类型的修复可纠正DNA双螺旋上错配的碱基对，还可修复因复制打滑而产生的核苷酸插入或缺失。MMR的过程需要区分母链和子链，做到只切除子链上错误的核苷酸，而不会切除母链上的正常核苷酸。修复的过程是：识别出正确的链，切除掉不正确的部分，然后通过DNA聚合酶III和DNA连接酶的作用，合成正确配对的双链DNA。3.6单核苷酸多态性（SNP）是指由单个核苷酸A、T、C或G的改变而引起的DNA序列的改变，造成包括人类在内的物种之间染色体基因组的多样性。3.7
10、等位基因一般是指位于一对同源染色体相同位置上控制某一性状的不同形态的一对基因。若成对的等位基因中两个成员完全相同，则该个体对此性状来说是纯合子。若两个等位基因各不相同，则该个体对该性状来说是杂合子。3.85-氟尿嘧啶一种嘧啶类似物，作为胸苷酸合成酶抑制剂，阻断DNA复制的必需原料胸腺嘧啶的合成。主要用于肿瘤的治疗。3.9光密度表示紫外光照射下被检测物吸收的光密度，260nm波长下的吸光值（DNA吸收峰值）可用来表示DNA的相对浓度，具体换算公式为：DNA浓度（ng/ml）=OD260X50X稀释倍数。3.10基因芯片将大量（通常每平方厘米点阵密度高于400）的核酸探针分子固定于支持物
11、上并与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。3.11基因是遗传物质的最小功能单位，是指具有一定生物学意义的一段DNA。3.12基因型又称遗传型，是某一生物个体全部基因组合的总称，它反映生物体的遗传构成，即从双亲获得的全部基因的总和。据估计，人类的结构基因有3万个。因此，整个生物的基因型是无法表示的，遗传学中具体使用的基因型，往往是指某一性状的基因型。3.13基因组生物标志物是一种可用于指示正常生物学过程、病理过程和/或对治疗及其他干预措施反应性的可测量的DNA或RNA特性。其中DNA的特性可包括但不仅限于单核苷酸多态性、短序列重复次数多态性
12、、单倍型、DNA修饰如甲基化、核苷酸的插入/缺失、拷贝数变异及细胞遗传学重排如转位、重复、缺失或反转。RNA特性包括但不仅限于RNA序列、RNA表达水平、RNA处理过程（如剪接和编辑）、微小RNA。3.14检出限（limitofdetection，LOD）标本中一种分析物可被检出的最低的含量，这一分析物含量可能不是量化的具体数值。3.15健康保险隐私及责任法案（healthinsuranceportabilityandaccountabilityact，HIPAA）美国政府1996年颁布的、医疗服务行业必须遵守的法案。该法案制定了一系列安全标准，就保健计划、供应商及结算中心如何以
14、价室间质量评价是多家实验室分析同一标本，并由外部独立机构收集和反馈实验室上报结果、评价实验室操作的过程，也称能力验证。3.21脱氧核糖核酸（DNA）核酸的一种，是由特殊序列的脱氧核糖核苷酸单元（dNTP）构成的多聚核苷酸，起携带遗传信息的功能。DNA为一种双链分子，通过核苷酸碱基对间的氢键维系。DNA包含的4种核苷酸包括：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（G）。人类存在两种类型的DNA：来自染色体的基因组DNA（gDNA）和线粒体DNA。3.22能力验证（proficiencytesting，PT）多个标本周期性地发送到实验室进行分析和（或）鉴定，将每一实验室的结果与同组的
15、其他实验室的结果或指定值进行比较，并将比较结果报告给参与的实验室，同室间质量评价。3.23生物标记物（biomarker）患者标本中所含有的一种特殊的分析物质（如DNA、RNA、蛋白质等），可用于疾病诊断、判断疾病分期或评价新药或新疗法在目标人群中的安全性和有效性。3.24微卫星指基因上含有重复的DNA短小序列或单核苷酸的区域，每个单元长度在1-6bp之间。根据重复单元的构成与分布，微卫星DNA序列可分为3种类型：单一型、复合型和间断型。3.25微卫星不稳定性（microsatelliteinstability，MSI）是指肿瘤基因组特定的微卫星位点与其对应的非肿瘤基因组相比，因重复单位的
16、缺失或插入而造成的结构性等位基因的大小发生改变，出现新的微卫星等位基因现象。3.26线性在已知的范围内，某检测提供的结果能够直接与标本的浓度（或量值）成比例关系的能力。3.27相对定量通过标准曲线法和CT值比较法测定目的基因的相对表达量，以比较两个或多个样本中目的基因的表达差异。该方法通常用来检测基因表达量是上调还是下降。3.28遗传药理学研究机体的基因多态性对药物反应个体差异的影响，是药物基因组学的重要内容。3.29药物不良反应（adversedrugreaction,ADR）是指上市的合格药品在常规用法、用量情况下出现的，与用药目的无关，并给患者带来痛苦或危害的反应。3.30药物的反
17、应性包括药物吸收和分布（即药代动力学）、药物效应（如药物效应动力学）、药物的疗效及药物不良反应。3.31药物基因组学研究人类基因组信息与药物反应之间的关系，同时也可以发现药物新靶点和提高临床试验的成功率。3.32荧光定量PCR通过应用荧光染料或荧光标记的特异性探针，对聚合酶链反应产物进行标记跟踪，实时监控反应过程，结合相应的软件可以对荧光信号进行分析，实现基因检测的定性和（或）定量分析。3.33荧光原位杂交（FISH）一种细胞遗传学技术，可以用来对核酸进行检测和定位。荧光标记的核酸探针只与具有高度相似性的核酸杂交，可用于染色体上基因的定位和定量。3.34杂交两个以上的分子具有相近的化学结构和性
19、条件下进行多次测定时，所得测定结果之间的符合程度，表示测量结果中的随机误差大小的程度。3.40特异性（specificity）在出现干扰现象（影响量）时，试验或检测程序能够正确地识别或定量确定某一实体物质的能力。4.药物代谢酶和药物作用靶点基因检测分析前质量保证根据临床检验实验室的条件确定合适的分子诊断项目和恰当的样本处理是确保核酸定性定量检测准确性的关键。标本在检测前必须确保标本的采集、运输和储存符合要求。标本处置不当可能引起核酸降解，导致定量检测结果不准确。4.1采样前准备1）分子诊断项目的申请与完善药物代谢酶和药物作用靶点基因检测采样前需填写规范的申请单，申请单应包含足够的信息，
20、以识别患者和有资格开具申请单的临床医生。临床医生应根据临床需求合理选择分子诊断项目。个体化用药领域发展迅速，临检实验室应加强与临床医师的沟通，及时指导临床医师选择有价值的诊断项目，帮助医师合理解释检验结果；不断接受正确合理的临床医师的反馈意见，及时了解临床对个体化用药分子检测的需求，优化项目目录。实验室应根据其具体的工作流程，确定质量监测指标，如患者诊断信息完整率、适当临床判断率等，并定期对数据进行回顾性分析，定期对检验申请进行评审。2）患者的正确识别及知情同意患者的正确识别是确保获得正确的临床标本的前提。收集标本的容器上应注明患者的信息，通常应包括姓名、送检医院及科室、住院号等。医护人员在采
23、脉血液采集之前应按要求对预采血的部位彻底消毒。肿瘤组织中DNA的分析利用常规诊断所用的标本即可，但用于RNA分析的标本需专门采集，并准备好液氮等速冻所需的材料及设备。标本采集需要在密闭、一次性采样系统中完成，所用的材料如注射器、棉签、拭子等应为一次性使用，以防止污染。无论采集哪种类型的标本，采样时都必须戴手套，以避免标本中病原微生物感染和皮肤脱落细胞对标本的污染。用于药物代谢酶和药物作用靶点基因检测的标本类型有多种，包括全血标本、组织标本（新鲜组织、冰冻组织、石蜡包埋组织、穿刺标本）、口腔拭子、骨髓、胸腹水等。样本采样原则见个体化医学检测质量保证指南。1）全血和骨髓标本全血标本采集到含有适当抗
24、凝剂或添加物的采样管中，添加物根据被测量（DNA、细胞内RNA）、检测项目和采样体积而定。因肝素可抑制PCR，全血或骨髓标本一般用EDTA或枸橼酸盐抗凝。采样前需在采样管或注射器上标注标本信息。全血标本采集外周静脉血23mL并置于采血管中，将采血管轻轻颠倒混匀数次以确保充分抗凝，避免溶血。如检测目的是细胞内RNA，建议用含RNA稳定剂的采样管，或采样后尽快将全血或骨髓加入到RNA稳定溶液中。采集干血斑标本时，可向无菌滤纸上滴加约50mL全血，根据需要可连续在数个印圈上滴加标本，于室温自然干燥至少4小时。干血斑标本采集时不要堆叠血斑，不与其他界面接触，待血斑充分干燥后应放入无菌袋中，避免血斑
27、较小的组织（如活检组织标本）固定612小时，较大的组织（如手术切除标本）固定648小时。甲醛固定的石蜡包埋组织不适于用作RNA检测，但在没有其他标本可供选择时，可考虑选择没有污染部分提取的RNA用于检测，待测RNA序列的长度最好<130bp。组织标本切片时应特别注意避免标本间的交叉污染。c)组织切片：用于DNA检测时，手术标本需提供10m厚的石蜡切片48张，面积为成人拇指盖大小；活检穿刺标本提供10m厚切片810张。所有切片均为白片。肿瘤组织切片应在HE染色后，经病理医师显微镜下观察，以判断是否含有肿瘤细胞及肿瘤细胞的数量是否足够（一般要求>50）、坏死组织比例<10
34、药物作用靶点基因检测必须有严格的质量控制措施，涉及基因扩增的检测项目必须在通过技术审核的临床基因扩增检验实验室完成。分析中质量控制的内容包括：实验室设计的要求；检测程序的选择、验证及确认；仪器设备的使用、维护与校准；人员培训；样本的准备（如核酸纯化等）；执行检测；确认检测结果的可靠性。实验室应制定室内质量控制操作程序（SOP）和参加室间质评或实验室间比对。5.1实验室设计要求原则上按照个体化医学检测质量保证指南的要求进行。作为药物代谢酶和药物作用靶点基因检测核心技术之一的PCR，要保证结果的可靠性和准确性，首要措施就是防“污染”。检测实验室应按医疗机构临床基因扩增实验室管理办法要求进行设置，
35、并按要求严格控制空气流向，避免PCR产物污染。5.2检测方法药物代谢酶和药物作用靶点基因检测过程一般包括核酸提取和靶标检测两阶段。5.2.1核酸提取方法DNA提取用酚-氯仿提取法和盐析法等均可。酚-氯仿法提取可能导致DNA样品中酚或氯仿残留，从而抑制后续的PCR反应。盐析法提取可能存在蛋白质及其他物质的残余，DNA的纯度和得率不高。DNA提取操作要求在生物安全柜内进行。DNA一般溶解在pH为7.2的TE（Tris-EDTA）溶液中，可减少其降解。但如果DNA在提取后几天内用于PCR，也可用双蒸水进行溶解。提取出的DNA要求OD260/280介于1.61.8之间，浓度大于50ng/L。D
38、杂交（ISH）等多种方法，每种方法的原理和优缺点如下：1）PCR-直接测序法也称PCR-Sanger测序，该方法基于双脱氧核糖核酸（ddNTP）末端终止法，根据核苷酸在某一固定点开始延伸，随机在某一特定碱基处终止，由于掺入的每个碱基都进行了荧光标记，因此产生了以A、T、C、G结束的四组相差一个碱基的不同长度的系列核酸片段；通过毛细管电泳分离这些片段后读取待测核酸的碱基序列。Sanger法测序是DNA序列分析的经典方法。由于该方法可直接读取DNA的序列，因此被认为是基因分型的金标准。PCR-Sanger测序法的操作过程主要包括PCR扩增和PCR产物纯化、测序反应、测序和结果分析四个主要步骤。分析
39、时需要设置阴性对照和阳性质控品。该方法属于定性检测，优点是测序长度较长，可发现新的变异位点。主要不足：灵敏度不高，尤其是在进行肿瘤组织体细胞突变检测时，当组织中靶标基因突变比例低于20时，可能出现假阴性结果；对试剂和仪器有特殊要求，不易普及；操作复杂，成本相对较高，速度慢、通量低。2）PCR-焦磷酸测序法本方法是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。实验需设计一条生物素标记的测序引物，当引物与单链模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实
40、时测定DNA序列的目的。所需试剂包括样本处理试剂、核酸扩增试剂、单链模板制备试剂、焦磷酸测序试剂和阳性质控品五大类。所需仪器为PCR仪和焦磷酸测序仪。为避免假阳性和假阴性结果，应严格区分阳性质控品和反应试剂的使用，防止因试剂污染致假阳性发生。该方法的主要优点：检测灵敏度较高，对体细胞突变和甲基化等可实现定量检测；分型准确可靠，通量较高，实验设计灵活，可发现新的突变或遗传变异。主要缺点：对试剂和仪器有特殊要求，不易普及；检测灵敏度有限，对肿瘤组织中的低丰度体细胞突变（<3）容易出现假阴性；测序长度仅10多个碱基，不能对长片段进行分析。3）实时荧光PCR法根据检测原理的不同，实时荧光PCR法
41、可分为探针法和非探针法两种，前者利用与靶序列特异杂交的探针（Taqman和分子信标）来指示扩增产物的增加，后者利用荧光染料或特殊设计的引物来指示扩增产物的增加。Taqman探针法同时综合了5端核酸酶活性和荧光等技术，其在反应过程使用4条寡核苷酸链，其中两条为等位基因特异性探针，两条为PCR引物。两条探针可分别与突变型和野生型模板互补，其两端分别应用含报告基团和淬灭基团的染料进行标记，两条探针的报告基团荧光染料不一样。在进行SNP检测时，PCR扩增的退火过程导致探针与模板杂交结合，当引物延伸至探针处时，DNA聚合酶的5端外切酶活性将探针的5端报告基团从探针上切除，使之与淬灭基团分离，从而释放出相
42、对应的荧光，而没有配对的探针仍然保持完整而不会发荧光。不同的等位基因探针由于标记的荧光染料不同，因此所发荧光信号不同，可通过对荧光信号的检测判断样本的基因型。实时荧光PCR法灵敏度高，分型准确，操作简便快捷，所用仪器容易普及，易于推广使用。但该方法通量不高，探针成本较高，单个位点的检测成本与样本量有关，样本量越小，成本越高。本方法主要适于对少量位点、大样本进行分型。目前CFDA已批准CYP2C9、VKORC1等多种基因多态性检测的PCR-荧光检测试剂盒。4）PCR-基因芯片法该方法以特定的寡核苷酸片段作为探针，将其有规律地排列固定于支持物上，然后将样品DNA通过PCR扩增、荧光标记等程序，按碱
43、基配对原理与芯片杂交，再通过荧光检测系统对芯片上的荧光信号进行检测和分析，从而迅速获得个体的基因型信息。基因芯片分型法的操作过程包括PCR核酸扩增、杂交、芯片扫描和结果分析。该方法用于DNA基因分型时属于定性检测，灵敏度为50ng/L。基因芯片法分析时需设置阴性对照和阳性质控品。应用基因芯片检测试剂盒时应确保试剂在开封前按要求保存、各组分液体使用前振荡混匀，杂交和洗片操作务必在避光条件下进行，PCR反应液和定位参照需避光保存，芯片加样时注意使液体铺满整个反应区，但不能溢出、不能出现气泡，以防交叉污染。其主要优点是可同时对多个待测SNP位点进行检测。我国CFDA已批准多种用于药物代谢酶和药物作
44、用靶点基因如ALDH2、CYP2C9、CY2C19、CYP2D6、ADR1、ACE、VKORC1多态性检测的基因芯片试剂盒。5）PCR-电泳分析该方法是指对待分析的目的基因片段进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳分析，根据PCR产物的大小对基因多态性位点进行基因分型。该方法属于定性检测，且只能用于对已知的多态性位点进行检测，不能识别未知多态性。琼脂糖电泳法适用于对片段较长的插入缺失多态性进行检测，如ACE插入缺失多态性；毛细管电泳法适于对较短的插入缺失多态性如UGT1A1*28多态性和微卫星不稳定性（MSI）进行检测。PCR过程中需建立阳性质控品和阴性质控品，电泳分析时需同时用分子
46、荧光染料，该类染料在饱和浓度时对PCR反应无抑制作用，因此可以高浓度使用，从而全部结合DNA双螺旋结构中的小沟。在双链DNA的变性过程不存在荧光分子的重排，其特异度得到大幅提升，因此，熔解曲线细微的变化可以反映扩增片段中碱基的差异。应用本方法进行基因分型属于定性分析。该方法操作简便、快速、通量大、使用成本低、结果准确，有利于实现闭管操作，在进行甲基化检测时可根据熔解曲线确定甲基化程度的高低。该方法的缺点是：不能排除待测核酸中新出现的遗传变异；由于单个碱基突变导致DNA解链温度的变化非常小，该方法对仪器的灵敏度和分辨率有较高要求。7）等位基因特异性PCR（Allele-specificPCR，
47、AS-PCR）又称为扩增阻滞突变系统PCR（AmplificationRefractoryMutationSystemPCR，ARMS-PCR）。该技术的基本原理：由于TaqDNA聚合酶缺乏3到5端的外切酶活性，3端错配的碱基会导致引物延伸速度变慢，当错配达到一定程度时，引物延伸将终止，得不到特异长度的PCR扩增产物，从而提示模板DNA没有与引物3端配对的碱基，反之则有。因此，AS-PCR反应需要两条等位基因特异的引物和一条共用的反向引物，两条非特异性引物在3端与模板错配，但其他部分碱基序列完全一样。只有引物的3端与模板完全配对时，PCR扩增才可以进行。PCR产物可通过凝胶电泳进行分
48、析和基因型的判断。该方法也可与实时荧光定量PCR结合起来进行基因分型。该方法可以用于检测各种类型的SNP，其优势是灵敏度高，特别适合于对肿瘤组织中的体细胞突变进行检测；缺点是假阳性率较高。8）PCR-限制性片段长度多态性方法限制性片段长度多态性方法（RFLP）是一种基于酶切原理的方法，是最早用于基因分型的经典方法之一，现在仍被广泛采用。该方法主要基于某些限制性内切酶可以特异性识别某一特定序列和结构DNA，并对其进行剪切的原理。限制性内切酶通常识别双链DNA的某一特定序列，并在特定位置或者附近将双链DNA切断，从而产生较短的DNA片段。由于限制性内切酶识别序列的严格性，一个碱基的变化都可以导致酶
49、切活性的消失。利用这一特性，若待分型的SNP位点在某一限制性内切酶的识别位点上，将会导致该酶只对其中的一种等位基因具有酶切活性。因此，对位于限制性酶切识别位点的SNP进行分型时，可以使用包含该位点的PCR产物与相应的限制性内切酶进行温育。酶切以后的产物进行电泳，并根据酶切产物片段的大小来进行基因分型。该方法不需要任何探针，也不需要特别的仪器设备，成本较低，实验过程简单，可操作性强。但缺点也很明显，主要是通量太低，大量分型时工作量大，并且只适用于部分SNP分型。9）原位杂交（ISH）法ISH法以各种人体标本，包括相应实验方法制备的细胞学和组织学标本（福尔马林固定石蜡包埋）作为靶标，采用目的DNA
51、行检测，可用于mRNA表达检测。焦磷酸测序高通量，高灵敏度，可以检测插入/缺失突变和未知突变。等位基因含量的比例可用于室内质控。需要特殊仪器设备。适合于较大样本、突变比例高于5的各种类型SNP检测、甲基化位点的确定。HRM成本低，灵敏度高，闭管操作，降低污染风险。需要特殊仪器设备，条件摸索过程较为困难适合有该类机器的实验室开展各种类型SNP分型研究；可用于已知甲基化位点的检测。Sanger法测序直接获取序列，分型的金标准，可发现未知突变。通量低，不能检测突变比例小于20的SNP。各种SNP的检测，未知突变的筛查以及验证其他分型的结果。PCR-RFLP无需特殊的仪器设备，成本较低，实验过程简单，
54、运体基因遗传多态性检测、药物作用靶点基因遗传变异检测、其他基因变异检测和药物作用靶点基因mRNA表达检测四种类型（附录C）。5.3仪器设备的使用、维护与保养原则上按照个体化医学检测质量保证指南的要求进行。药物代谢酶和药物作用靶点基因检测涉及的仪器设备众多，实验室可参考生产商提供的操作说明书编写书面的、有案可查的预防性维护及校准计划，确定仪器设备的维护周期，建立仪器设备日常维护的SOP。对于某些计量分析仪器，应依照我国计量法规定，由计量检定机构定期进行校验，并保存好校验证书。加热系统及冰箱等设备的维护包括对温度进行监测。仪器维护过程中要注意清洁剂的使用，尤其是仪器的光路系统。每台仪器应该配备专用
55、的清洁工具。在例行仪器的维护和保养后，应填写仪器维护保养记录表。如维护中发现问题，应及时汇报并将出现的问题详细记录，最后由维护操作人员签名。5.4人员培训原则上按照个体化医学检测质量保证指南的要求进行。药物代谢酶和药物作用靶点基因检测通常要涉及试剂配制、核酸提取、仪器编程、结果分析和报告等步骤。操作人员需要有一定的专业技术知识和经验才能获得稳定可靠的检测结果。加强人员培训是确保检测质量的关键。人员培训分为入职培训、内部培训和外部培训。通过培训，让操作人员掌握和建立安全操作的概念、“防污染”的概念、具备独立进行质控活动和仪器维护的能力，可对试剂和质控品的出入库及使用情况、设备保养等情况进行准确记
58、精密度、线性、可报告范围、检出限、参考区间、灵敏度、特异性等。准确度的评价有两种方法，一种方法是与标准物质进行比较，使用待评估的项目对已知标准的标准物质（如定性检测中用到的阳性参照品）进行分析，将检测结果与已知标准值进行比较；第二种方法是同时用待评估项目与标准方法（或参考方法）对同一批次样品进行分析，然后将不同方法得到的结果进行对比分析。精密度是指重复检测条件下，获得的独立测量结果间的一致程度，是对检测体系随机误差的一种度量，常用标准差表示，标准差越小精密度越好。定性检测的精密度还包括一份阳性或阴性样本在多次检测中，是否能得到可重复的阳性或阴性结果。药物代谢酶和药物作用靶点基因变异检测体系进行准确度、精密度等性能验证时所使用的参考物质为各种突变型和野生型质粒或突变细胞株。线性分析可直