本发明涉及包括基因的鉴定方法，特别涉及动物产品的源性检测及真假鉴别的方法。
背景技术：
从古至今，仅凭传统感官评价和近代理化检测均不能准确鉴定动物产品中的源性成分，因此在动物产品中偶有掺假造假现象却难于判定。随着现代分子生物学中pcr技术的广泛普及，其对样品dna的准确鉴定，成为了动物产品中源性成分的重要鉴定方法，很多掺假造假事件从而被检出和曝光。由于掺假动物产品绝大部分有添加香精香料、添加调味剂、已经过深加工等迷惑措施，而普通消费者仅通过感官品评，基本不能辨别，因此食品安全问题堪忧。
pcr技术鉴定动物产品掺假造假的检测方法，是通过在样品dna中检测物种特异基因，从而判定样品是否含有该物种源性成分。
第一代pcr技术，通常称为普通pcr技术，先设计物种特异基因的引物，再将样品dna和引物及扩增试剂混匀后通过pcr仪对目的基因进行反复扩增，然后通过电泳对扩增产物进行鉴定，从而判定是否含有该物种源性成分。
第二代pcr技术为实时定量荧光pcr，通常简称荧光pcr。除了设计物种特异基因的引物外，再设计一条荧光探针。将样品dna、引物、探针及扩增试剂混匀后通过实时定量荧光pcr仪(通常简称荧光pcr仪)对目的基因进行反复扩增，探针的荧光信号累积与基因扩增同步，相对普通pcr，既提升了扩增时的特异性，扩增结束后也立即获得检测结果。
多重实时定量荧光pcr(以下简称多重荧光pcr)属于荧光pcr的一种，针对多个物种特异基因，逐个设计引物和探针，不同探针分别标记上不同波长的荧光基团。将样品dna、引物、探针及扩增试剂混匀后通过多通道荧光pcr仪对多个目的基因进行反复扩增，通过监测多个荧光信号达到同时检测多个物种特异基因的要求。相对普通荧光pcr，每增加一套引物和探针即可将检测效率提升一倍、并将其他试剂成本降低一倍。
技术实现要素：
本发明旨在提供检测5种动物源性成分的四重荧光pcr方法，以解决鼠、兔、马、驴、骡5种动物制品的真假鉴别问题。
发明人提供的检测5种动物源性成分的四重荧光pcr方法，具有多重荧光pcr技术的4个要素，即：样品dna、两套引物和四条探针、荧光pcr预混液、阳性对照；发明特点是根据田鼠(microtus)、兔(oryctolaguscuniculus)、马(equuscaballus)、驴(e.asinus)的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因设计引物和探针，仅能对目标序列进行扩增并激发荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号；将待测样品dna进行荧光pcr扩增的试剂配方和扩增条件制成试剂盒；具体的做法包括：
第一步，建立检测鼠、兔、马、驴、骡源性成分的四重荧光pcr引物和探针体系；
第二步，建立检测鼠、兔、马、驴、骡源性成分的四重荧光pcr试剂盒；
第三步，确定检测鼠、兔、马、驴、骡源性成分的四重pcr鉴定方法，即以待测样品总dna为模板，利用所述的四重荧光pcr引物和探针体系，在可同时检测fam、vic、cy3、cy5荧光激发信号及bhq1、bhq2荧光淬灭信号的四通道及以上的多重荧光pcr仪上进行扩增和检测。
上述检测鼠、兔、马、驴、骡5种动物源性成分的四重荧光pcr引物体系见附录：序列1为鼠、兔的通用上游引物，序列2为鼠、兔的通用下游引物，序列3为马、驴的通用上游引物，序列4为马、驴的通用下游引物，序列5为鼠特异性探针，序列6为兔特异性探针，序列7为马特异性探针，序列8为驴特异性探针。序列5、6、7、8在5’端分别用fam、vic、cy3、cy5荧光激发基团修饰，序列5、6的3’端均用bhq1荧光淬灭基团修饰。序列7、8的3’端均用bhq2荧光淬灭基团修饰。
上述检测鼠、兔、马、驴、骡5种动物源性成分的四重荧光pcr试剂盒成分如下所示：
①引物溶液：包括序列1、2、3、4所示引物，浓度均为20μmol/l；使用1.5ml无色透明离心管封装；
④探针溶液：包括序列5、6、7、8所示探针，浓度均为10μmol/l，使用1.5ml棕色不透明离心管封装；
③荧光pcr试剂：经验证可适用于所述的四重荧光pcr引物体系的外购的试剂套装，包括荧光pcr预混液、rox染料、三蒸水；
④阳性对照：包括含有序列1、2、3、4所示引物扩增目的片段的鼠、兔、马、驴、骡源性dna，浓度均为105拷贝/μl左右，使用1.5ml无色透明离心管封装。
一.质控标准：阳性对照的fam、vic、cy3、cy5荧光信号有荧光对数增长，且ct值≤30.0；阴性对照和空白对照无荧光对数增长，ct值≥40.0。满足上述条件后，可进行第二、三项的鼠、兔、马、驴、骡源性成分判定。
二.鼠、兔：
①阳性样品：fam或/和vic有荧光对数增长，且ct值≤30.0，表明该样品检出鼠或/和兔源性成分。
②阴性样品：fam或/和vic无荧光对数增长，ct值≥40.0，表明该样品未检出鼠或/和兔源性成分。
③疑似样品：fam或/和vic有荧光对数增长，且30.0<ct值<40.0，重复检测一次。复检结果ct值≥40.0，表明该样品未检出鼠或/和兔源性成分；复检结果ct值<40.0，表明该样品检出鼠或/和兔源性成分。
三.马、驴、骡：
①阳性样品：cy3或cy5有荧光对数增长，且ct值≤30.0，表明该样品检出马或驴源性成分，且无骡源性成分；cy3和cy5均有荧光对数增长，且ct值≤30.0，表明样品具有以下4种源性成分组合中的1种组合：马、驴，马、骡，驴、骡，马、驴、骡。
②阴性样品：cy3或/和cy5无荧光对数增长，ct值≥40.0，表明该样品未检出马或/和驴源性成分，且无骡源性成分。
③疑似样品：cy3或/和cy5有荧光对数增长，且30.0<ct值<40.0，重复检测一次。复检结果cy3或/和cy5的ct值<40.0，等同“①阳性样品”进行判定；复检结果cy3或/和cy5的ct值≥40.0，等同“②阴性样品”进行判定。
上述反应液配制如表1所示：
表1反应液配方
注1：当荧光pcr仪需要rox染料校准时加入相应浓度，否则不应添加，具体要求荧光pcr仪说明书。
注2：阳性对照为所述试剂盒成分“阳性对照”，阴性对照为非鼠、兔、马、驴、骡源性dna或三蒸水，空白对照为三蒸水。
上述设置的反应条件如表2所示：
表2反应条件
注1：生物热敏抗体为20–120s；化学热敏抗体为10–15min。
注2：检测荧光信号。
附图说明
图1为实验结果的曲线图。
图中：曲线1-4与曲线5-8分别为检测样品与阳性对照的fam、vic、cy3、cy5荧光信号曲线，曲线9-16为阴性对照和空白对照的fam、vic、cy3、cy5荧光信号曲线。
具体实施方式
实施例1自制样品
表3反应体系
表4反应条件
注*：检测荧光信号。
检测结果见图1和表5：
①图1中曲线1至4与曲线5至8分别为检测样品与阳性对照的fam、vic、cy3、cy5荧光信号曲线，曲线9至16为阴性对照和空白对照的fam、vic、cy3、cy5荧光信号曲线。
②质控标准：阳性对照的fam、vic、cy3、cy5荧光信号有荧光对数增长，且ct值≤30.0；阴性对照和空白对照无荧光对数增长，ct值≥40.0。
③检测样品：fam、vic、cy3、cy5均有荧光对数增长，且ct值≤30.0，表明该样品检出鼠、兔源性成分，并具有以下4种源性成分组合中的1种组合：马、驴，马、骡，驴、骡，马、驴、骡。
④比对结果：与按照gb/t21102-2007《动物源性饲料中兔源性成分定性检测方法实时荧光pcr方法》(下同)、sn/t3730.4-2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第4部分驴成分检测实时荧光pcr法》(下同)、sn/t3730.5-2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第5部分马成分检测实时荧光pcr法》(下同)对样品进行兔、马、驴源性成分检测的结果相符；鼠源性结果与省内同行业检测单位比对检测结果相符。
表5实验结果：实测ct值及有无荧光信号对数增长曲线
实施例2企业委托样品---田鼠干的检测
表6反应体系
表7反应条件
检测结果见表8：
①质控标准：阳性对照的fam、vic、cy3、cy5荧光信号有荧光对数增长，且ct值≤30.0；阴性对照和空白对照无荧光对数增长，ct值≥40.0。
②检测样品：fam有荧光对数增长，且ct值≤30.0，表明该样品检出鼠源性成分。vic、cy3、cy5无荧光对数增长，ct值≥40.0，表明该样品未检出兔、马、驴、骡源性成分。
③比对结果：与按照gb/t21102-2007、sn/t3730.4-2013、sn/t3730.5-2013对样品进行兔、马、驴源性成分检测的结果相符。鼠源性结果与省内同行业检测单位比对检测结果相符。
表8实验结果：实测ct值及有无荧光信号对数增长曲线
实施例3国家监督抽查风险检测样品---泡椒兔丁的检测
表9反应体系
表10反应条件
检测结果见表11：
②检测样品：vic有荧光对数增长，且ct值≤30.0，表明该样品检出兔源性成分。fam、cy3、cy5无荧光对数增长，ct值≥40.0，表明该样品未检出鼠、马、驴、骡源性成分。
③比对结果：与按照gb/t21102-2007、sn/t3730.4-2013、sn/t3730.5-2013对样品进行兔、马、驴源性成分检测的结果相符。
表11实验结果：实测ct值及有无荧光信号对数增长曲线
实施例4省级监督抽查检测样品---餐饮马肉的检测
表12反应体系
表13反应条件
检测结果见表14：
②检测样品：cy3有荧光对数增长，且ct值≤30.0，表明该样品检出马源性成分。fam、vic、cy5无荧光对数增长，ct值≥40.0，表明该样品未检出鼠、兔、驴、骡源性成分。
表14实验结果：实测ct值及有无荧光信号对数增长曲线
实施例4个人委托样品---阿胶的检测
表15反应体系
表16反应条件
检测结果见表17：
②检测样品：cy5有荧光对数增长，且30.0<ct值<40.0，复检仍有荧光对数增长，且ct值<40.0，等同阳性样品进行判定，表明该样品检出驴源性成分。fam、vic、cy3无荧光对数增长，ct值≥40.0，表明该样品未检出鼠、兔、马、骡源性成分。
表17实验结果：实测ct值及有无荧光信号对数增长曲线
序列表
<110>贵州省产品质量监督检验院
<120>一种检测5种动物源性成分的四重荧光pcr方法
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>2
<211>260
<212>dna
<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum
<400>2
atntnvrsncrtsandryctagscncsccccaggtctacatgttccagtcrtsandryct60
agscncstcctggaagatggtgatggcscabasandsasnsctgtgcctaatcacctctt120
ggscabasandsasnstttatcttccttgagcaaccctcrtsactccacccatggcaary180
ctagscncsattccacccacggcaascabastggtcatacagtgacagctcccsasnsca240