2019年12月底，在中国湖北省武汉市当地的一个海鲜和野生动物交易市场：武汉华南海鲜市场，一种可导致不明原因肺炎的病毒爆发了。在2020年1月7日，中国疾控中心CCDC确证了这是一种新型冠状病毒。2020年2月11日，世界卫生组织将这次大规模流行疾病命名为2019-nCoV（2019-novelcoronavirusdisease），也称为COVID-19.此外，国际病毒分类委员会将2019-nCoV命名为严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2）。2020年3月，COVID-19在全球爆发。新型冠状病毒从属于CoronaviridaeNidovirales中的beta型（betaCoV），是一类衣壳包裹的单链RNA病毒。通常BetaCoV以啮齿类动物作为宿主，在无中间宿主的情况下很少感染到人类。然而分别在2003年爆发的SARS，和在2016年爆发的MERS同样从属于BetaCoV，并对人类的公共卫生安全造成了巨大的伤害。研究表明，新冠病毒与蝙蝠冠状病毒RaTG13具有98%的相似度，与蝙蝠类SARS病毒CoVZXC21具有89%的核苷酸序列相似性，与人类SARS病毒有79%的同源性。截止到目前，尚未出现对于新冠病毒有效的治疗手段和药物。
本次新冠病毒的爆发给我们带来了前所未有的危机，对人类健康和生命造成巨大的威胁，给全球经济带来了灾难性的损失。值得庆幸的是，21世纪以来生物科学的快速发展极大的提高了全球针对重大传染性疾病的应对能力。在本次疫情爆发的几天内，新冠病毒的完整基因组数据即被公开，一个月内，针对新冠病毒的核酸检测试剂盒即开发完毕、投入使用。目前，全世界的科学家、医务工作者、生物医药企业等已经团结起来，对该疾病进行更加深入的了解，为遏制新冠病毒的转播及开发有效的治疗、预防手段贡献力量。
本文将从COVID-19致病机理、检测/诊断技术两个方面，浅述生物技术在新冠病毒诊疗中的应用。
CO-19致病机理
与其他的感染呼吸道的冠状病毒类似，SARS-CoV-2主要是通过空气传播：病毒通过空气中的小液滴或气溶胶被吸入肺部，从而感染患者。另外，SARS-CoV-2还存在尚未被确证的粪-口传match播途径。新冠病毒的平均潜伏期中位数约在4～5天，之后97.5%的感染者在11.5天内出现感染症状。其典型的早期感染症状与SARS十分类似，包括发热、干咳，一些病人出现呼吸困难、肌肉/关节疼痛、头晕/头痛、腹泻、呕吐及咳血等症状。症状出现5～6天后，病毒载量达到高峰，随着病毒对下呼吸道的感染升级，气道的炎症反应加剧，导致肺部组织破坏，一些严重的患者在症状出现8～9天左右出现急性呼吸窘迫症ARDS（表现为呼吸困难和血氧浓度降低）、细菌和真菌的继发性感染、免疫系统大量分泌抗炎细胞因子形成细胞因子风暴（CRS），以及多脏器衰竭等。最终，一些患者由于血氧过低、脏器衰竭等走向死亡（男性死亡率2.8%，女性死亡率1.7%）。
SARS-CoV-2通过其病毒衣壳上的刺突蛋白S中的RBD（receptor-bindingdomain）靶向呼吸道中的上皮细胞、肺泡上皮细胞、血管内皮细胞和巨噬细胞表面表达的ACE2（angiotensin-convertingenzyme2）。如图所示，在感染过程中，SARS-CoV-2的RBD与细胞表面的ACE2结合，诱导细胞的内吞作用。在该作用中细胞丝氨酸蛋白酶TMPRSS2也起到了一定的辅助。通过内吞，病毒的RNA顺利进入细胞质并进行迅速的翻译、表达、复制，造成细胞的裂解以及ATP、核苷酸等大量释放。这些细胞损伤信号被周围的上皮细胞、内皮细胞、肺泡巨噬细胞等接收，并诱导它们释放出IL-6，IP-10，MIP1alpha，MIP1beta，以及MCP1等炎性因子。这些炎性因子吸引单核细胞、巨噬细胞和T细胞至感染处，进一步促进炎症反应，形成正向反馈机制。
在免疫应答不健全的情况下（图左），可造成更多的免疫细胞在肺部聚集，炎症反应加剧，最终导致肺部组织的破坏。而高浓度的炎症因子会随血液全身循环至多处脏器，造成多脏器损伤。此外B细胞分泌的非中和抗体（通过ADE.antibody-dependentenhancement），进一步加剧了器官损伤，最终导致器官衰竭。然而在正常的免疫应答中（图右），T细胞可在病毒扩散之前清除感染的细胞。患者体内产生的中和抗体可遏制病毒进一步感染、扩散，肺泡中的巨噬细胞可通过吞噬作用清除被中和的病毒颗粒和凋亡的细胞。快速的病毒清除可避免不必要的炎症反应，从而将肺部损伤降到最低，促进肺组织的痊愈。
图1.新冠病毒感染细胞过程（图源：NatureReviewImmunology）
COVID-19体外检测技术
对于新型冠状病毒的检测对于预防、防治疾病扩散和进展具有举足轻重的作用。在疫情爆发的早期，由于人们对于疾病的认知不足，很容易从一些共有的临床表现上，把新冠和其他的肺炎、流感、普通感冒发烧混淆在一起。再加上新冠病毒的传播能力强、速度快、致死率高，如何有效、快速、准确的诊断出新冠感染患者，及时施以隔离、干预和入院治疗等手段，最大程度的切断感染源，挽救更多患者的生命成为此次疫情防治中的重中之重。
1.核酸检测方法学
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荧光定量RT-PCR
核酸检测具有早期诊断、灵敏度和特异性高等特点，是确诊新冠肺炎的“金标准”。首先需要对含有病毒的样本进行灭活提取RNA，通过逆转录的方式获得病毒的cDNA，然后通过一对和病毒基因组特定片段互补的引物进行PCR扩增，一般检测位于病毒ORF1ab和N基因上的两个靶标，同一份标本需要满足双靶标阳性或重复检测为单靶标阳性或两种标本同时满足单靶标才能确认SARS-CoV-2病毒核酸阳性。核酸检测样本类型一般为鼻咽拭子、痰液、支气管灌洗液和肺泡灌洗液。检测程序经过取样、留样、保存、核酸提取、上级检测等一系列步骤。
此处的“荧光”表示在PCR反应过程中引入荧光示踪物1.加入能够指示DNA片段扩增过程的荧光染料（SYBRGreen等）或2.荧光标记的特异性探针（Taqman等），其荧光信号的积累与PCR产物的浓度有一定的换算关系。在PCR过程中，仪器不断记录荧光信号，通过标准曲线法对未知模板进行定量分析。
图2.SYBRGREEN和TAQMAN探针QPCR原理（图源：WILEYONLINELIBRARY）
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数字PCR（ddPCR）
数字PCR可以做到对目标核酸序列的定量和定性检测，将具有荧光定量PCR的反应物（Taqman探针或SYBRGreen引物）加载到液滴式微流控芯片上，然后用ddPCR扩增仪进行扩增。在反应完成后可通过成像分析，输出原始数据，并经由软件分析得到最终结果。ddPCR以qPCR为基础，但可以做到绝对定量。即，将一个标准的qPCR反应分配到大量微小的反应器中（反应单元），每个反应器中包含1个或多个拷贝的目标分子（DNA模版），实现“单分子模版PCR扩增”反应。在反应结束后，通过判别“阳性”和“阴性”反应器结果，利用泊松分布原理进行统计分析，通过读取阳性反应单元的个数及比例从而得出靶分子的起始拷贝数或浓度。根据反应单元的不同形式，主要可分为微板式、微腔式和微滴式三大类系统。
微滴式ddPCR在技术原理、通量和反应单元数等方面均优于微腔式（芯片式），更符合实际应用需求，设备包括微滴生成仪、微滴反应仪和微滴检测仪三个部分，目前越来越多的厂家逐渐将其组分进行整合，以形成ddPCR的一步操作。另外，各大ddPCR体外诊断厂家也针对样本前处理、核酸提取、反应体系混合等研发了全自动的解决方案。后续在同一张芯片耗材上进行多重标记物扩增或增加加样通道等可增加ddPCR单次的检测效率与检测通量。
缺点：正由于ddPCR对于低拷贝数也能检出，因而对于可能的样本污染必须特别小心，环境中的一丁点污染都有可能在实际过程中检出。在一体化检测方案出现之前，操作步骤和检验步骤较为复杂，对检验师要求较高。另外，较高的背景降噪技术与荧光阳性判读算法对于ddPCR的精准度非常重要。
核酸等温扩增技术
近年新发展起来的核酸等温扩增技术，在实际操作或仪器要求方面都比PCR技术更为简单方便。新兴的等温扩增技术包括环介导等温扩增、链替代等温扩增、滚环等温扩增、依赖解旋酶等温扩增、依赖核酸序列等温扩增、单引物等温扩增和核酸快速等温检测放大等技术。
环介导等温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP）
LAMP是Notomietal.于2000年提出来的一种新的核酸扩增技术，其原理主要是基于靶基因3'和5'端的6个区域设计3对特异性引物，包括1对外引物、1对环状引物和1对内引物，3种特异引物依靠链置换BstDNA聚合酶，使得链置换DNA合成不停地自我循环，从而实现快速扩增。反应1h后可根据扩增副产物焦磷酸镁沉淀形成的浊度或者荧光染料进行判断扩增情况。此反应先形成哑铃状模板，进入循环扩增阶段，再进行伸长、循环扩增，共3个阶段。
图4.LAMP原理（图源：ResearchGate）
依赖核酸序列的扩增(Nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA)
依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)是1991年由加拿大Can-gene公司首次介绍。它是一项以核酸序列中RNA为模板，由两个引物介导的、连续均一的特异性体外等温扩增核苷酸序列的酶促过程。整个反应由非循环相和循环相组成:首先进行非循环相，在AMV逆转录酶的作用下，引物I与模板RNA退火后合成cDNA，形成RNA/DNA杂合体，随即RNaseH降解RNA，引物Ⅱ与cDNA退火，合成第二条DNA互补链。形成的DNA双链由T7RNA聚合酶识别启动子序列，催化合成RNA，进入循环相，对模板进行大量扩增。
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滚环扩增技术(Rollingcircleamplification,RCA)
1998年建立的滚环扩增(RCA)是模拟自然界微生物环状DNA的滚环复制过程，发展起来的一种放大信号和靶核酸相结合的检测方法。在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下由一条引物与环形DNA模板的链置换合成，实现环状DNA模板的体外等温线性扩增。可分为线性扩增(单引物RCA)、指数扩增、多引物扩增和信号扩增RCA。
图6.多种RCA原理（图源：ChemicalSocietyReviews）
图7.RCA扩增产物的多元化检测手段（图源：ChemicalSocietyReviews）
4、单引物等温扩增技术(Singleprimerisothermalamplification，SPIA)
SPIA的核心是一条混合引物及可以切割DNA/RNA杂合链中RNA部分的RNA酶，由3'端DNA部分和5'端RNA部分组成。在反应过程中，RNaseH不断降解引物区DNA/RNA双链中的RNA部分，暴露出模板上与引物RNA部分结合的位点，然后新引物结合上去进行链置换合成，经过RNA降解、新引物结合、链置换的循环过程，实现模板互补序列的快速扩增。
图8.SPIA扩增原理（图源：Springer）
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依赖解旋酶DNA等温扩增技术(Helicase-dependentisothermalDNAamplification，HDA)
依赖解旋酶DNA等温扩增技术(HDA)是美国NEB公司于2004年发明的一种新型核酸等温扩增技术。该技术模拟体内DNA复制的自然过程，利用解旋酶在恒温下解开DNA双链，再由DNA单链结合蛋白稳定已解开的单链为引物提供模板，然后在DNA聚合酶的作用下合成互补的双链，继而不断重复上述循环扩增过程，最终实现靶序列的指数式增长。
图9.HDA扩增原理（图源：ResearchGate）
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重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)
RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37摄氏度左右。
图10.RPA扩增及检测原理（图源：ResearchGate）
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链替代扩增(Stranddisplacementamplification，SDA)
链替代扩增(SDA)技术最早是由Walker等人于1992年在《美国国家科学院汇刊》中进行了介绍，这是一种基于酶促反应的DNA体外等温扩增技术，主要利用限制性内切酶剪切DNA识别位点的能力和DNA聚合酶在切口处向3'延伸并置换下游序列的能力，在等温条件下进行扩增。整个过程由准备单链DNA模板、生成两端带酶切位点的目的DNA片段、SDA循环扩增3个步骤组成。
图11.SDA扩增原理（图源：ResearchGate）
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切口酶扩增（Nickingenzymeamplificationreaction,NEAR）
NEAR是2000年成立的IonianTech的技术，在2010年被Alere收购，Alere在2017年被雅培收购。反应体系中包括三种酶：反转录酶、恒温扩增酶（Bst）、切口酶（Nickingenzyme）。上下游引物在恒温扩增酶作用下对靶序列进行链置换扩增，切口酶可识别特定序列切下8-16个碱基单链后，形成缺口。缺口可利用恒温扩增的DNA聚合酶继续合成短序列。在60摄氏度下，合成的短序列自动解旋，成为恒温扩增酶的进一步模版。新合成的短序列单链之后与带有荧光的引物结合，从而通过荧光来定量分析。当荧光达到一定的强度，认定相应的病毒DNA达到一定含量。
图12.NEAR扩增及检测原理（图源：ACSPublications）
无论通过上述任何核酸等温技术，都可以通过在扩增产物上添加荧光染料、使用荧光标记探针、通过反应产生的能量激发luciferase等荧光素酶等进行显色，通过读取荧光或层析的方式来实现定性检测。
2.CRISPR方法学
CRISPR全称是ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats（成簇的规律间隔的短回文重复序列），而Cas的全称是CRISPRassociated（CRISPR关联）。CRISPR/Cas系统是一种原核生物的免疫防御系统，用来抵抗外来遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒等。同时，它为细菌提供了获得性免疫（类似于哺乳动物的二次免疫），当细菌遭受病毒入侵时，会产生相应的“记忆”。当病毒二次入侵时，CRISPR系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达，抵抗病毒的干扰。
其主要原理为当噬菌体病毒首次入侵细菌，病毒的双链DNA被注入细胞内部。CRISPR/Cas系统会从这段外源DNA中截取一段序列作为外源DNA的“身份证”，然后将其作为新的间隔序列被整合到基因组的串联间隔排列的“重复序列”，即CRISPR序列之中。在病毒再次入侵DNA时，表达产生CRISPRRNA（crRNA），同时CRISPR序列附近的保守蛋白编码基因（成为Cas基因）可表达一种核酸酶（Cas酶），这种酶和crRNA共同作用，识别入侵病毒的DNA靶序列并进行切割，实现对入侵病毒的免疫应答。
CRISPR/Cas的强大之处在于，其可以对基因进行定点的精确编辑。在向导RNA（guideRNA，gRNA）和Cas9蛋白的共同作用下，细胞基因组DNA（看成外源DNA）将被精确剪切。但是，被CRISPR/Cas9剪切需要满足几个条件。第一，待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列（NGG）。第二，向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。最基础的应用就是基因敲除。如果在基因的上下游各设计一条向导RNA（gRNA1，gRNA2），将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，gRNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。随后生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。如果在此基础上为细胞引入一个修复的模板质粒（供体DNA分子），这样细胞就会按照提供的模板在修复过程中引入片段插入（Knock-in）或定点突变（site-specificmutagenesis）。这样就可以实现基因的替换或者突变。随着研究的深入，CRISPR/Cas技术已经被广泛的应用，除了基因敲除，基因替换等基础编辑方式，它还可以被用于基因激活，疾病模型构建，甚至是基因治疗。
目前已发现的CRISPR/Cas系统大体可分为两类（如下图），Class1（包含了typeI,III,andIV），和Class2（包含了typeII和typeV和typeVI）。在Class1中,对于外源基因组的剪切需要一个大的Cas蛋白复合物（由不止一种Cas蛋白组成）和引导RNA。在Class2中，对于外源基因的剪切只需要一个单一的剪切蛋白,例如TypeII中的Cas9蛋白和TypeV中的cpf1蛋白。此外不同类型的CRISPR/Cas系统针对的靶标类型（DNA或RNA）以及是否需要crRNA都不相同。
在本次新冠疫情检测中，CRISPR/Cas技术创始发现的两位鼻祖，MIT的张锋团队（SHERLOCKBiosciences）和UCBerkeley的JenniferDoudna团队（MammothBiosciences）分别使用SHERLOCKV2技术和DETECTR技术针对新冠病毒检测开发了相应的检测试剂。
1、SHERLOCKV2
图14.SHERLOCKV2对于多重病原体检测原理（图源：Science）
图15.SHERLOCK检测新冠病毒试纸条（图源：FengZhangetal.AprotocolfordetectionofCOVID-19usingCRISPRdiagnostics）
2、DETECTR
UCBerkeley的JenniferDoudna教授发现CRISPR/Cas12a系统在剪切靶向的dsDNA时其核酸酶活性会被激活，进而可以非特异性的切割ssDNA。因此，如果反应体系中存在针对某种病毒的靶向dsDNA，并引入非特异性荧光标记的报告ssDNA，CRISPR/Cas12a系统一旦检测到目标DNA，就会诱发核酸酶活性，从而荧光报告基因也会被降解，从而释放出荧光信号。该技术被称为DETECTR（DNAEndonuclease-targetedCRISPRTransReporter）。
图16.DETECTR技术检测dsDNA原理（图源：hhmi）
优点：由于CRISPR/Cas系统的多元性，以及和等温核酸扩增的结合，可实现RNA和DNA分子的自由转换，因而对于RNA或DNA病毒皆可开发出相应的检测手段、试剂。CRISPR方法速度快（1小时内出结果）、灵敏度高（初始只需要数十个病毒拷贝）、操作简单、对于仪器要求低（只需要1个恒温模块，可能需要1个荧光收集模块）、单样本检测成本在1美元左右。
缺点：仍需要扩增，在野外、缺少供电或条件较差的环境较难使用，目前具备开发此类试剂的企业较少，技术在行业中处于转化的初期阶段。
3.抗体方法学
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抗原检测
优点：基于双抗夹心法开发的快速诊断试剂特异性高、检测速度快（10-15分钟）、对仪器无依赖、操作简便、假阳性低，因而适用于现场的快速检测。由于该方法对前期样本制备要求低，抗原蛋白又相对稳定，相对于核酸检测来说临床稳定性高。
缺点：对于较低的抗原浓度可能检测下限要求比较难达到。
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抗体检测法
《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》中，将患者的血清学指标即针对新冠病毒的特异性抗体IgM或IgG阳性作为诊断标准之一，这种方法称为抗体检测法，即使用抗抗体检测患者的免疫系统针对新冠感染产生抗体的一种检测。
图21.新冠病毒IgM/IgG快速检测试剂盒使用流程
图22.新冠病毒IgM/IgG快速检测试剂盒结果判读
除了胶体金、免疫层析等可开发快速检测试剂的方法，新冠病毒IgM/IgG也可以使用酶联免疫、化学发光、流式荧光等方法学进行检测。这些技术平台需要仪器辅助（流水线或者POCT），有的平台还伴有全自动样本处理、上级检测一体化解决方案，适用于大批量样本筛查，其检测速度也可以和快速检测相媲美。
结语
在全球范围内，各种诊断技术平台、方法百花齐放，与不同的国家地区、应用场景相结合或不同的检测方法之间相结合，有望在病毒感染人体的各个阶段，进行损伤最小、依从性最高、速度最快、成本较低的精准判断。同时，在针对新冠病毒疫苗治疗手段研发如火如荼的进程中，新冠病毒体外诊断技术也将为评估疗效、判断预后贡献一份巨大的力量。针对新冠疫情得以应用的新型体外诊断技术平台也可扩展适用于其他感染病原体、肿瘤辅助诊断、精准用药等项目，致力于我国IVD产业技术水平、服务质量的整体提升。