本申请涉及生物医药领域，具体涉及一种生物相容性吉西他滨给药系统及其制备方法和应用。
背景技术：
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本申请的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
作为致死率最高的癌症之一，目前大多数传统的抗肿瘤治疗对胰腺癌效果不佳。到目前为止，胰腺腺癌(pancreaticductaladenocarcinoma,pdac)的5年生存率仍低于10％。其中导致pdac高致死性的原因包括胰腺癌恶性程度高，易复发、转移，对放化疗耐药，对靶向治疗和免疫治疗不敏感以及早期诊出率低等。因此，如何提高pdac的治疗和诊断效果成为目前亟待解决的难题。
在诊断方面，胰腺癌尚缺乏有效的早期筛查方法，多数患者诊断时就已处于中晚期。mri因具有较高的软组织分辨率、多平面成像和无电离辐射等优势，被认为是针对肿瘤检测的一种理想成像手段。然而，由于胰腺肿瘤组织缺乏成熟的血管和富含纤维基质导致其与炎性肿块鉴别困难，同时目前临床常用的小分子对比剂是非细胞靶向性对比剂，因此常规mri在胰腺癌早期和特异性诊断方面依旧存在一定的困难。
技术实现要素：
具体地，本发明提供了下述的技术特征，以下技术特征的一个或多个的结合构成本发明的技术方案。
在本发明的第一方面，本发明提供了一种生物相容性吉西他滨给药系统，命名为mfc-gem，其包含药物吉西他滨(gem)和药物载体，所述药物载体为载mnfe2o4的焦糖化纳米球，命名为mfc，其中，药物吉西他滨共价负载在载mnfe2o4的焦糖化纳米球上。
在本发明的一些实施方式中，所述药物载体以戊二醛为交联剂；药物吉西他滨负载在载mnfe2o4的焦糖化纳米球上以nhs/edc为活化剂。
在本发明的一些实施方式中，所述焦糖化纳米球为非晶态结构；mfc为球状纳米结构，其平均粒径为100-130nm。在本发明的一些实施方式中，mfc-gem与mfc的动态光散射尺寸差异不大，在180nm左右，该尺寸使得mfc-gem能够在增强渗透和滞留效应(epr)的基础上被肿瘤细胞有效摄取。
在本发明的一些实施方式中，mfc具有较大的比表面积，比表面积可达36.54cm2/g，具有较高的载容量，在一些实施方式中，mfc中mnfe2o4的重量百分比可达236.8mg/g(mnfe2o4/mfc)。
在本发明的一些实施方式中，本发明的mfc-gem具有同步催化h2o2和gsh的能力，同时，mfc-gem具有ph响应性，可在肿瘤酸性环境中实现对于药物吉西他滨的释放，促进药物浓度进入肿瘤间质和细胞内。根据mfc-gem在体内的h2o2和gsh催化特性，mfc-gem处理的panc02细胞比gem、mfc及其他对照组相比显示出更强的dcf荧光信号，以及经mfc-gem处理的panc02细胞内的gsh含量相较于mfc组明显下降更为明显，表明，mfc-gem在体内相较于mfc、gem具有更好的催化h2o2和gsh的能力，以及经mfc-gem处理后panc02细胞内lipidros水平相较于gem、mfc组具有升高。以及，mfc-gem对panc02具有相较于gem、mfc更为显著地抑制作用，这表明mfc能显著增强gem对panc02的抑制作用，同时mfc-gem对正常细胞具有良好的生物相容性和可忽略的细胞毒性。以及，在体内肿瘤治疗的效果实验中，单独使用mfc或gem处理的小鼠肿瘤抑制效果不理想，相反，经mfc-gem处理的小鼠的肿瘤体积没有明显增加。以及，mfc-gem具有mr成像能力，在一些实施方式中，mfc-gem相较于相同条件下载fe3o4的实施方式(r2＝9.23mm-1s-1)，横向弛豫性可提高至少4.7倍。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种上述第一方面中所述的生物相容性吉西他滨给药系统的方法，其包括：将mnfe2o4负载在焦糖化纳米球上后进一步负载药物吉西他滨。
在本发明的一些实施方式中，所述方法包括：分别将焦糖化纳米球和mnfe2o4分散在溶剂中，混合，加入交联剂超声处理，静置，取上层液体进行磁选后干燥获得mfc；将mfc分散在缓冲溶液中，加入药物吉西他滨后与nhs/edc混合，避光剧烈搅拌，用磁性分离产物，并洗涤，即得。
在本发明的实施方式中，发明人发现，超声处理时加入交联剂，尤其是加入戊二醛，可保持mfc的球形度和高磁含量，避免了球形度差或不成球，包裹mnfe2o4少的缺点；同时，在进一步负载gem时，以nhs/edc为活化剂，能够更好的实现吉西他滨与mfc的偶联。
在本发明的第三方面，本发明提供了上述第一方面中所述的生物相容性吉西他滨给药系统在制备用于治疗胰腺癌的药物中的应用和/或制备用于胰腺癌诊断的mr成像剂中的应用。
在本发明的实施方式中，所述胰腺癌包括早期、中期和晚期胰腺癌。
相较于现有技术，本发明的优势在于：
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本申请的实施方案，其中：
图1为本发明cnss的tem图。
图2为纳米探针mfc的tem(a)，sem(b)；(c)纳米探针元素分布；(d)xrd图谱；(e)动态光散射图(左侧峰为cnss，右侧峰为mfc和mfc-gem，mfc、mfc-gem的峰线基本重叠)；(f)ftir光谱(曲线自上向下靠近坐标轴依次为mnfe2o4、gem、mfc-gem、mfc、cnss)。
图3为mfc的eds图谱。
图4为cnss和mfc的氮气吸附等温线。
图6示出了panc02、人胰腺导管上皮(ht-hpne)细胞和小鼠脐静脉内皮细胞(muvec)细胞活力(同一浓度下的三条柱状图自左至右分别对应ht-hpne细胞、muvec细胞和panc02细胞)。
图7示出了：(a)panc02细胞活力(每三个柱状图为一组，自左至右依次对应mfc、gem和mfc-gem)；(b)panc02细胞半数致死量(ic50)(左下方曲线对应mfc-gem，右上曲线对应gem)；(c)panc02内gsh水平(柱状图自左至右依次对应control、gem、mfc、mfc-gem、nem)；(d)dcfh-da染色的panc02细胞荧光图像。注：ns：p>0.05，*：p<0.05，***：p<0.001。标尺＝200μm。
图8示出了：(a)c11-bodipy581/591探针荧光成像，标尺＝200μm；(b)jc-1线粒体膜电位(δψm)染色结果，标尺＝400μm；(c)二氢乙锭(dhe)显示的超氧化物阴离子(o2·-)生成结果，标尺代表200μm。
图9示出了：(a)panc02活/死细胞染色，标尺＝200μm；(b)流式细胞术结果显示，与mfc-gem共同孵育后对panc02细胞凋亡和坏死水平增高；(c)，(d)caspase-3和gpx4蛋白的表达和蛋白表达定量分析，结果显示经mfc-gem处理后细胞内caspase-3表达量上升，gpx-4表达量下降(每组柱状图中自左至右分别对应caspase-3和gpx4)；(e)，(f)tem观察panc02细胞形态。注：(e)，(f)标尺分别为24μm和12μm；白色三角形表示mfc或mfc-g；白色箭头表示细胞核核内染色质。
图10示出了：(a)mfc-gem注射前后主要器官和肿瘤中mn和fe水平分布，表明纳米探针主要分布于肝脏、脾脏和肿瘤组织内(每两个柱状图为1组，自左至右分别对应fe和mn，上下同)；(b)、(c)溶血实验结果显示纳米探针不会导致红细胞发生明显溶血(b中同一浓度下的两条柱状图分别对应mfc和mfc-gem)；(d)治疗后小鼠主要器官切片的h&e染色，显示小鼠主要器官没有明显炎症及损伤，标尺＝200μm。
图11示出了：小鼠全血及生化检测，显示经尾静脉注射mfc-gem后小鼠血液生化指标均在正常水平内波动；注：灰色区域代表不同生物安全指标的正常范围。
图15示出了：(a)各种治疗后肿瘤片染色的gpx4(绿色)、caspase-3(红色)、tunel(绿色)和h&e染色图像，标尺＝100μm。(b)不同治疗组中panc02肿瘤的照片；(c)、(d)、(e)分别表示治疗后小鼠的相对肿瘤体积、体重变化和生存率曲线。(c肿瘤体积曲线中，曲线自上向下依次对应normalsaline、mfc、gem、mfc-gem；d体重变化曲线中，以靠近20天处垂直划线，曲线自上而下依次对应mfc-gem、mfc、gem、normalsaline，其中，nomalsaline曲线变化波动较大)注:ns:p>0.05、*:p<0.05、**:p<0.01或***:p<0.001。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本申请所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本申请所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明中涉及的术语：
pdac(pancreaticductaladenocarcinoma)：胰腺癌导管腺癌
gem(gemcitabine)：吉西他滨
cnss(carbonaceousnanospheres)：焦糖化纳米球
mfc(carbonaceousnanoparticles@mnfe2o4)：载mnfe2o4焦糖化纳米球
mfc-gem(gemcitabineloadedcarbonaceousnanoparticles@mnfe2o4)：载吉西他滨mnfe2o4焦糖化纳米球
panc02(murinepancreaticcancercells)：小鼠胰腺癌细胞
mri(magneticresonanceimaging)：磁共振成像
ros(reactiveoxygenspecies)：活性氧
pbs(phosphatebuffersaline)：磷酸盐缓冲液
se(spinecho)：自旋回波
δψm(mitochondrialmembranepotential)：线粒体膜电位
eds(energydispersespectroscopy)：x线能谱
xrd(x-raydiffraction)：x线动态光衍射
dls(dynamiclightscattering)：动态光散射
ftir(fouriertransformsinfraredspectra)：傅里叶变换红外光谱
tem(transmissionelectronmicroscopy)：透射电子显微镜
sem(scanningelectronmicroscopy)：扫描电子显微镜
icp-ms(inductivelycoupledplasma-atomicemissionspectrometry)：电感耦合等离子质谱仪
dfo(deferoxaminemesylate)：去铁胺甲磺酸
nem(n-ethylmaleimide)：n-乙基马来酰亚胺
lipidros(lipidperoxidation)：脂质过氧化物
o2·-(superoxideanion)：超氧化物阴离子
looh(hydroperoxidederivativesoflipids)：脂质过氧化氢衍生物
pufa(polyunsaturatedfattyacid)：多不饱和脂肪酸
实施例
一、纳米探针的制备及性能的测定
1.纳米探针的合成方法
1.1焦糖化纳米球(cnss)的合成：制备方法：首先将无水葡萄糖溶液(0.6m)加热到170℃反应7h。然后，将得到的棕色产物离心(12000rpm/min，10min)后用乙醇和水洗涤产物，直至呈现无色上清，最后将产物干燥备用。
1.2mnfe2o4的制备：将0.01molfecl3和0.01molmncl2在氮气环境下溶解在180ml水中。将10mlnh3.h2o迅速加入溶液，剧烈搅拌，加热并保持在80℃，10min。冷却到室温后，磁性分离产物，并用水反复清洗。最后，干燥纳米颗粒备用。
1.3mnfe2o4负载焦糖化纳米球(mfc)的制备：将20mg干燥cnss溶解在50ml水中。另外，秤取20mgmnfe2o4超声分散于50ml水中。将上述溶液混合，加入1.0ml戊二醛超声处理1h，然后在室温下搅拌12h。然后将悬浮液静置15min，取上层液体进行磁选。对产物mfc洗涤和干燥，以供进一步使用。
1.4gem负载mfc(mfc-gem)的制备：将15mgmfc分散在50mlpbs(ph6.0)并超声分散。溶液中加入10mggem后将溶液与nhs和edc(4mm：4mm)混合后，在室温避光剧烈搅拌12h，用磁性分离产物，用去离子水洗涤。产物收集待用。
2纳米探针的表征与化学性质检测
2.1纳米探针表征：利用透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscopy，tem)，扫描电子显微镜(scanningelectronmicroscopy，sem)及元素分析仪对纳米探针的形貌特征、大小及元素构成进行表征。通过纳米粒度及电位分析仪对cnss、mfc及mfc-gem的流体力学半径及电位分布进行测量。通过xrd及紫外-可见光分析仪验证mnfe2o4及gem的负载情况。利用傅里叶变换光谱对mfc、mfc-gem的结构和功能基团进检测。
3纳米探针mr成像能力测试
4细胞实验
4.1细胞培养
4.1.1细胞复苏从液氮环境中取冻存细胞，放置于37.5℃的恒温水浴箱，在水浴箱中直立摇晃细胞冻存管使冻存液在2min内融化，注意防止水浴箱内的水没过冻存管封口。超净工作台紫外光灭菌30min后，将融化细胞液用灭菌移液枪迅速移至配好的6mlrpmi-1640完全培养基(含10％fbs及1％p/s)中，将细胞吹打均匀。1000rpm/min离心5min后弃掉上清，然后加入5ml含血清的完全培养基，并轻轻吹匀细胞后转移至细胞培养瓶中。在37℃、5％co2恒温培养箱中培养24h隔夜后更换细胞液，换液后将细胞置于恒温培养箱中继续培养。
4.1.2细胞传代光学显微镜下观察细胞贴壁生长至80％～90％后，对细胞进行传代。在紫外光灭菌30min后的超净工作台中，使用移液枪吸出培养瓶内原有的培养基，加入适量的无菌冷pbs溶液洗涤细胞3次。吸出pbs并加入1.5ml含edta胰酶消化液，使胰酶消化液充分浸润细胞。显微镜下观察细胞变圆、间隙增大后，加入2ml含血清完全培养基，并吹打细胞使其脱落。将细胞悬液转移至15ml离心管中，1000rpm/min离心5min后弃掉上清，加入适量培养基后轻轻吹散细胞后转移至细胞培养瓶中继续培养。
4.1.3细胞冻存将处于对数生长期且生长至80％～90％的细胞进行冻存。在紫外光灭菌30min后的超净工作台中，用移液枪吸出培养瓶内原有的培养基，加入适量的无菌冷pbs溶液洗涤细胞3次。吸出pbs并加入1.5ml含edta胰酶消化液，使胰酶消化液充分浸润细胞。显微镜下观察细胞变圆、间隙增大后，加入2ml含血清完全培养基，并吹打细胞使其脱落。将细胞悬液转移至15ml离心管中，1000rpm/min离心5min后弃掉上清，加入适量完全培养基后轻轻吹散细胞。用移液枪取细胞冻存液细胞轻轻吹散细胞，随后将细胞悬液移至冻存管中。标注日期，细胞名称。置于在-80℃冰箱内过夜，最后将细胞冻存管移至液氮中进行长久保存。
4.2细胞毒性实验
为了验证纳米探针的细胞毒性将panc02，htert-hpne及muvec三种细胞置于96孔板中，每孔8×103个细胞。培养24h贴壁。分别将panc02，htert-hpne及muvec细胞与不同浓度(12.5、25、50和100μg/ml)的mfc共同孵育24h后每孔加入10μl的cck-8并37℃孵育40min，用酶标仪测试450nm处吸光度。将未处理细胞设为控制组，无细胞孔作为空白组。假设对照组细胞活力为100％。分别计算细胞活力，取平均值。细胞活力％＝(mfc细胞od－空白组od)/(对照组od－空白组od)×100％。类似的，为了评估mfc-gem相对于mfc及gem对panc02细胞的杀伤作用，将细胞置于96孔板中，每孔8×103个细胞。培养24h贴壁。分别将panc02细胞与不同浓度的gem(3、6、12和24μm)，mfc(12.5、25、50和100μg/ml)以及mfc-gem(12.5、25、50和100μg/ml)共同培养24h。然后，每孔加入10μl的cck-8，37℃孵育40min，用酶标仪测试450nm处吸光度。并计算细胞活力，计算方式同上。使用graphpadprism软件计算细胞半数致死量(ic50)。
4.3细胞摄取量检测
首先将处于对数生长期的panc02细胞分别接种到6孔板(每孔5×105个细胞)中并培养24h使其贴壁。pbs洗涤细胞，加入mfc-gem(100μg/ml)，pbs作为对照组，恒温培养箱中继续培养4h。pbs洗涤细胞3次，加入0.5ml含edta的胰蛋白酶消化液消化，收集细胞于15ml离心管中1000rpm/min离心5min，离心后加入培养基重悬细胞。用细胞计数板对细胞进行计数，计数后1000rpm/min离心细胞5min，弃上清，加入事先已经配置好的王水消化细胞。3天后，加入5ml超纯水稀释定容用icp-ms测定每个离心管中的锰和铁的浓度，并计算出细胞内的锰和铁的质量。
4.4细胞内ros含量检测
利用dcfh-da检测gem，mfc，和mfc-gem诱导panc02细胞产生的ros含量。将panc02细胞置于24孔板中孵育每孔1×105个细胞。待细胞贴壁后用pbs洗涤两次，每孔分别加入1ml的pbs，gem(12nm)，mfc(100μg/ml)，mfc-gem(100μg/ml)以及mfc-gem(100μg/ml)+dfo(80μm)孵育12h。用pbs洗涤细胞3次，然后，加入dcfh-da(10μm)37℃孵育30min。用pbs洗涤3次去除多余的dcfh-da，荧光倒置显微镜观察并拍照。
4.5细胞内gsh含量测试
4.6细胞内lipidros含量测试
将panc02细胞置于24孔板中孵育每孔1×105个细胞，贴壁后，pbs洗涤2次。每孔分别加入gem(12nm)、mfc(100μg/ml)和mfc-gem(100μg/ml)以及mfc-gem(100μg/ml)+fer-1(100μm)。孵育24h后用pbs洗涤3次，加入1.5ml含有hoechst33342(5μg/ml)的完全培养基孵育10min。然后用pbs洗涤细胞3次后，将使用完全培养基配制的浓度为8μm的c11bodipy581/591与细胞共同孵育20min。pbs洗涤细胞，荧光倒置显微镜观察并拍照。
4.7线粒体膜电位(δψm)水平和超氧阴离子(o2·-)测定
用jc-1探针检测panc02细胞的线粒体膜电位：用gem(12nm)，mfc(100μg/ml)和mfc-gem(100μg/ml)处理细胞6h后，用jc-1(5μm)在37℃染色25min。随后，用pbs洗涤panc02细胞两次，荧光显微镜监测jc-1的绿色和红色荧光。超氧阴离子(o2·-)测定采用二氢乙锭(dihydroethidium，dhe)。用gem(12nm)，mfc(100μg/ml)和mfc-gem(100μg/ml)处理细胞12h后，将panc02细胞与6μmdhe避光孵育20min用荧光倒置显微镜观察细胞并拍照。
4.8mfc-gem体外治疗效果和机制评价
用calcein-am/pi试剂评价mfc-gem对panc02细胞的杀伤作用。将panc02细胞置于24孔板中孵育每孔1×105个细胞，贴壁后，pbs洗涤2次。每孔分别加入gem(12nm)，mfc(100μg/ml)和mfc-gem(100μg/ml)。24h后，pbs洗涤细胞三次。将细胞与calcein-am(1μm)和pi(2μm)共同孵育25min。用荧光倒置显微镜观察细胞并拍照，观察细胞内红色和绿色荧光分布。
用流式细胞术评价细胞凋亡和坏死水平。首先，将panc02细胞置于24孔板中孵育(每孔1×105个细胞)贴壁后，pbs洗涤2次。每孔分别加入gem(12nm)，mfc(100μg/ml)和mfc-gem(100μg/ml)孵育24h后，pbs洗涤细胞3次，并用不含edta的胰酶消化液消化细胞，待细胞悬浮后，用移液枪转移至15ml离心管，1000rpm/min离心5min。弃掉细胞上清液，每孔细胞加入预冷的2ml细胞缓冲液，1000rpm/min离心细胞5min，弃掉上清液。重复3次后，每孔加入annexinv-fitc(5μl)及pi(10μl)混合液并加入预冷的135μl细胞染色缓冲液，避光，4℃孵育15min。用流式细胞仪检测细胞凋亡和坏死水平。其中左下象限被认为是活细胞，而右下，右上象限分别表示早期凋亡，晚期凋亡和坏死细胞。
4.9线粒体形态学检测
tem观察肿瘤细胞器形态学变化。首先，将panc02细胞置于6孔板中。贴壁后每孔分别加入gem(12nm)，mfc(100μg/ml)，mfc-gem(100μg/ml)和erastin(10μm)共同孵育24h，收集细胞，用2.5％戊二醛在4℃环境下过夜固定。pbs洗涤细胞后，用乙醇和丙酮脱水。样品用包埋剂和丙酮处理。最后，用柠檬酸铅溶液和乙酸铀酰染色后，用tem观察切片。
4.10蛋白质表达分析
4.10.1蛋白质浓度测定：在提取蛋白时，采用bca法测定蛋白质浓度：将标准蛋白配置成0.5mg/ml的蛋白标准溶液，充分溶解现配现用。根据说明试剂a体积比试剂b体积为50:1配制bca工作液充分混匀后使用。在96孔板中加入0、1、2、4、8、12、16μl的标准蛋白溶液，加入无菌pbs溶液补足到20μl。向各孔中加入200μla工作液37℃放置30min，测定562nm波长处各孔的吸光度，绘制标准蛋白曲线，再计算出样品的蛋白浓度。
4.10.2蛋白质印迹，具体步骤如下：
(1)根据目的蛋白的分子量大小配制合适的分离胶(表1，表2，表3)。
(2)使用微量移液器上样，marker3μl/孔，样品15μl/孔，注意避免气泡的产生。
(3)将电泳胶板放入配置好的电泳液中，连接好电泳仪，80v恒压电泳30min后120v恒压电泳至上样缓冲液到达胶板底部。
(5)用5％脱脂牛奶覆盖pvdf膜，置于摇床上，常温下封闭2h。
(6)4℃孵育一抗过夜，tbst洗膜3次，10min/次，将pvdf膜浸没于二抗稀释液中，室温孵育2h。
(7)tbst细膜3次，15min、次。将1:1配置的ecl发光液滴加到pvdf膜上，在化学成像发光仪上曝光，image-proplus6.0软件分析条带。
表1蛋白的分子量大小与配制分离胶浓度关系
表25％浓缩胶配制
表312％浓缩胶配制
5动物实验
动物实验通过山东大学齐鲁医院动物伦理委员会及动物保护委员会批准；使用6-8周龄雌性balb/c小鼠购于济南朋悦实验动物有限公司，济南；spf级辐照词料：北京华阜康有限公司，北京。
5.1动物模型的构建
将处于对数生长期的panc02细胞消化、离心并收集、计数；将0.1ml的含1×106细胞的细胞悬液注入小鼠后腿皮下，spf级环境继续饲养小鼠14天左右，每隔一天观察肿瘤的生长情况，定期测量肿瘤体积(肿瘤体积＝肿瘤长径×短径2/2)。当肿瘤体积达到60mm3时，用于实验研究。
5.2体内生物相容性和生物分布评价
5.2.1溶血实验为了评估mfc和mfc-gem的溶血特性，取4ml新鲜抗凝血。将2ml的血液分散到4ml的pbs(ph7.4)中，1200rpm/min下离心10min，分离红细胞(rbcs)。用生理盐水冲洗三次至上清液无色后，用生理盐水稀释红细胞，得到2％(v/v)红细胞悬液。在37℃条件下，将不同最终浓度(25、50、100和200μg/ml)的mfc、mfc-gem与红细胞悬液共孵育1h。同时，选择等量蒸馏水和生理盐水作为阳性(溶血率：100％)和阴性(溶血率：0％)对照。孵育后，将样品离心(1200rpm，10min)，将所有样品的上清液100μl转移到96孔板上，用微板阅读器测量570nm处吸光度。溶血率用溶血比用下列公式表示：溶血比＝(样品od-阴性对照od)/(阳性对照od-阴性对照的od)×100％。
5.2.2系统毒性评估：通过静脉尾静脉给药，分别用gem(0.6μmol/kg)，mfc(5mg/kg)和mfc-gem(5mg/kg)尾静脉注射panc02荷瘤balb/c小鼠。生理盐水作为对照组行尾静脉注射。注射18天后进行常规血液检查和血液生化指标。
5.2.3组织器官h&e染色颈椎脱臼法处死小鼠，每组小鼠生理灌注后取主要器官固定于10％福尔马林溶液中进行h&e染色，步骤如下：
(1)从福尔马林将取出组织标本，选取合适部位，切块，置于包埋盒中，流水冲洗过夜去除标本内甲酸，选择自动脱水机相应程序脱水，石蜡包埋，
利用切片机切成0.5μm厚度切片，37℃水浴展片，65℃烘干切片。
(2)切片脱蜡：①二甲苯ⅰ15min；②二甲苯ⅱ15min；③无水乙醇10min；④95％乙醇10min；⑤80％乙醇5min；⑧70％乙醇2min；⑦流水ⅰ2min；⑧流水ⅱ2min；⑨流水冲洗2min。。
(3)将切片置于苏木精染色3min，蒸馏水洗涤30s。
(4)将切片放于1％盐酸酒精中分化5s，流水冲洗，65℃温水中浸没20s反蓝。
(5)将切片浸入伊红染色液染色2min。
(6)脱水、透明
(7)中性树脂封片，显微镜观察并拍照。
5.2.4纳米探针生物分布使用mfc-gem(5mg/kg)尾静脉注射panc02荷瘤balb/c小鼠。注射后获取小鼠主要组织器官(心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织)。尾静脉注射生理盐水的荷瘤小鼠作为对照组。将器官组织放入65℃烘干组织块。将组织块研磨，称取质量并记录。王水消解3d。通过icp-ms检测每种组织中的锰、铁分布情况。
6mr体外及体内检测
6.1细胞mr成像检测
用3.0tmr扫描仪验证纳米探针体外mr成像能力。将panc02细胞置于24孔板中孵育每孔1×105个细胞，贴壁后，pbs洗涤2次，每孔加入mfc(100μg/ml)，等体积加入pbs作为对照。孵育0.5、1、2和4h后用含edta的胰酶消化液消化细胞并离心。pbs重悬细胞，利用t2fse序列获取t2加权图像，参数如下：矩阵＝256×256，tr＝2000ms，te＝62ms；用以下公式计算t2加权信号变化：sii/sicx100％(i＝0.5、1、2和4h)，其中sic和sii分别是panc02细胞与mfc孵育前和0.5、1、2、4h后的信号强度。
6.2普鲁士蓝细胞染色
通过普鲁士蓝细胞染色对细胞成像结果进行验证：将panc02细胞置于24孔板中孵育每孔1×105个细胞，贴壁后，pbs洗涤2次，每孔加入mfc(100μg/ml)，等体积加入pbs作为对照。在孵育0.5、1、2和4h后。将perlsstaina：perlsstainb试剂1:1混合，配制perlsstain染色液现配现用。按照以下步骤染色：(1)4％多聚甲醛固定细胞15min。(2)自来水冲洗细胞2次，每次2min。(3)蒸馏水冲洗2次，每次2min。(2)perlsstain染色液浸染细胞15min。(3)蒸馏水充分冲洗3min。(4)核固红染色液，淡染切10min。(5)自来水冲洗5s。(6)显微镜观察并拍照。
6.3荷瘤小鼠mr成像检测
首先对小鼠称重，腹腔麻醉并固定小鼠。生理盐水溶解mfc在尾静脉注射前及尾静脉注射mfc(5mgfe/kg)0.5、1、2、4、12和24h后，利用自旋回波序列在3.0tmr扫描仪获得panc02荷瘤小鼠的t2加权磁共振图像。其参数如下：矩阵＝256×256，fov＝18×18mm2，切片厚度＝1.5mm，tr＝3000ms，te＝42ms，采集次数＝2。取注射前和注射后的冠状位mr图像。
6.4普鲁士蓝组织切片染色
通过普鲁士蓝组织切片染色对mr成像结果进行验证，步骤如下：
(1)从福尔马林将取出肿瘤标本，选取合适部位，切块，置于包埋盒中，流水冲洗过夜去除标本内甲酸，选择自动脱水机相应程序脱水，石蜡包埋，利用切片机切成0.5μm厚度切片，37℃水浴展片，65℃烘干切片。
(2)切片脱蜡：①二甲苯ⅰ15min；②二甲苯ⅱ15min；③无水乙醇10min；④95％乙醇10min；⑤80％乙醇5min；⑧70％乙醇2min；⑦流水ⅰ2min；⑧流水ⅱ2min；⑨流水冲洗2min。
(3)perlsstaina：perlsstainb试剂1:1混合，配制perlsstain染色液现配现用。
(4)perlsstain染色液浸染切片20min
(5)蒸馏水充分冲洗5min。
(6)核固红染色液，淡染切片10min。
(7)自来水冲洗5s。
(8)进行脱水、透明：①70％乙醇5s；②80％乙醇10s；③90％乙醇15s；④95％乙醇15s；⑥无水乙醇ⅰ15min；⑧无水乙醇ⅱ5min；⑦二甲苯ⅰ5min；⑧二甲苯ⅱ5min。
(9)中性树脂封片，显微镜观察并拍照。
7体内治疗效果及机制评估
7.1mfc-gem的抗肿瘤机制探究
为了研究mfc-gem的抗肿瘤机制，在将治疗18天后的小鼠颈脱臼法处死，经生理盐水充分灌洗后，取出并固定肿瘤组织。经切片，h&e、gpx4、caspase-3和tunel染色后，光学或荧光倒置显微镜观察切片并拍照，根据肿瘤组织形态，凋亡情况，caspase-3和gpx4蛋白表达情况探究mfc-gem对体内肿瘤组织的治疗机制。具体切片及染色步骤如下：
7.1.1h&e染色(1)从福尔马林将取出肿瘤标本，选取合适部位，切块，置于包埋盒中，流水冲洗过夜去除标本内甲酸，选择自动脱水机相应程序脱水，石蜡包埋，利用切片机切成0.5μm厚度切片，37℃水浴展片，65℃烘干切片。
(2)切片脱蜡：①二甲苯ⅰ15min；②二甲苯ⅱ15min；③无水乙醇10min；④95％乙醇10min；⑤80％乙醇5min；⑧70％乙醇2min；⑦流水ⅰ2min；⑧流水ⅱ2min；⑨流水冲洗2min。(3)将切片置于苏木精染色3min，蒸馏水洗涤30s。
(5)将切片浸入伊红染色液染色2min。(6)进行脱水、透明：①70％乙醇5s；②80％乙醇10s；③90％乙醇15s；④95％乙醇15s；⑥无水乙醇ⅰ15min；⑧无水乙醇ⅱ5min；⑦二甲苯ⅰ5min；⑧二甲苯ⅱ5min。(7)中性树脂封片，显微镜观察并拍照。
7.1.2gpx4、caspase-3组织免疫荧光染色(1)从福尔马林将取出肿瘤标本，选取合适部位，切块，置于包埋盒中，流水冲洗过夜去除标本内甲酸，选择自动脱水机相应程序脱水，石蜡包埋，利用切片机切成0.5μm厚度切片，37℃水浴展片，65℃烘干切片。(2)切片脱蜡：①二甲苯ⅰ15min；②二甲苯ⅱ15min；③无水乙醇10min；④95％乙醇10min；⑤80％乙醇5min；⑧70％乙醇2min；⑦流水ⅰ2min；⑧流水ⅱ2min；⑨流水ⅲ2min。(3)pbs洗涤切片3次，95℃edta抗原修复(4)用4％多聚甲醛固定15min，pbs洗涤切片3次。(5)采用1％bsa室温下对切片进行孵育30min，封闭抗原(6)pbs洗涤切片3次，3％triton通透10min。(7)切片上滴加稀释的一抗4℃，孵育过夜。(8)pbs洗涤切片3次，用稀释的含荧光标记二抗，37℃避光染色1h。(9)pbs洗涤切片3次，加入dapi染色液复染细胞核，室温下孵育5min，pbs洗涤切片3次。(10)使用抗荧光淬灭剂封片，荧光倒置显微镜下观察荧光强度并随机拍照。
6.1.3tunel染色(1)从福尔马林将取出肿瘤标本，选取合适部位，切块，置于包埋盒中，流水冲洗过夜去除标本内甲酸，选择自动脱水机相应程序脱水，石蜡包埋，常温保存，利用切片机切成0.5μm厚度切片，37℃水浴展片，载玻片携取切片，65℃烘干切片。(2)切片脱蜡：切片脱蜡：①二甲苯ⅰ15min；②二甲苯ⅱ15min；③无水乙醇10min；④95％乙醇10min；⑤80％乙醇5min；⑧70％乙醇2min；⑦流水ⅰ2min；⑧流水ⅱ2min；⑨流水ⅲ2min。(3)滴加20μg/ml不含dnase的蛋白酶k，37℃室温孵育切片30min(4)pbs洗涤切片3次。(5)配制tunel检测液：tdt酶：荧光标记液：tunel检测液＝1:5:10。(6)用pbs洗涤切片3次，滴加50μltunel检测液，37℃避光孵育60min。(7)用pbs洗涤切片3次使用抗荧光淬灭剂封片，荧光倒置显微镜下观察荧光强度并随机拍照。
7.2体内治疗效果评价
二、实验结果及分析
1纳米探针的化学表征及化学性质
1.1纳米探针的化学表征：通过mnfe2o4与cns配位合成mfc，并进一步负载gem合成mfc-gem。tem及sem(图1、图2a)显示cnss和mfc为球状纳米探针，且mfc表面覆盖着较多细小颗粒，表明mnfe2o4已经成功地负载在cns表面。图2b显示mfc的平均直径约为120nm。元素分布图显示(图2c、图3)显示c、o、fe和mn的元素分散在mfc上，进一步说明mnfe2o4在cns表面成功负载。cns和mfc的xrd图谱(图2d)显示cns和mfc的衍射峰均在22°左右，且mfc显示出mnfe2o4的特征峰表明，焦糖化纳米球为非晶态结构且被负载在cns表面带有mnfe2o4。图2e显示cnss和mfc的动态光散射尺寸分别为150nm和180nm，这使得肿瘤细胞能够在增强渗透和滞留效应(epr)的基础上对其实现有效的摄取。cns和mfc的平均ζ电位分别为-28.9mv和-25.3mv，当mfc负载gem后时，ζ电位变为-22.1mv。用icp-aes测定mfc中mnfe2o4的重量百分比为236.8mg/g(mnfe2o4/mfc)。图4显示mfc比表面积为36.54cm2/g。
此外，利用傅里叶变换红外光谱(ftir)对cns和mfc的结构和官能团测试结果表明(图2f)，cns和mfc在1704和1625cm-1左右的峰分别是由于葡萄糖的芳构化形成的c＝o和c＝c的震动引起，这证实葡萄糖实现了焦糖化。在约3450cm-1处的oh特征峰以及o-h在1000-1300cm-1的弯曲振动范围显示cns和mfc表面具有大量的-oh，这表明纳米粒子具有较高的亲水性。同时，纳米探针在580cm-1处mfc的吸收带是由于mn-o和fe-o拉伸振动所致。gem在1063、1703和3395cm-1处的特征峰是由于c-f、c＝o和o-h/nh2的拉伸振动造成。因此，mfc-gem在1063、1703cm-1处的吸收峰表明gem成功负载到mfc纳米探针上。
1.2纳米探针的化学性质
1.2.2在gsh催化能力
1.2.3纳米探针gem释放能力
如图5f所示，在ph5.0和7.4的pbs环境中，前12h内，在ph5.0处mfc-gem能够快速释放药物，而当ph为7.4时，在前2h几乎没有gem释放。这表明在酸性条件下，mfc-gem的gem释放速率与ph7.4相比更为迅速。这显示出，mfc-gem可以肿瘤酸性环境中实现gem的ph响应性反应释放，进而促进药物浓度进入肿瘤间质和细胞内。
1.3纳米探针的mr成像能力及t2弛豫率
2mfc-gem体外生物实验
2.1mfc-gem的细胞毒性
细胞毒性实验是用来评价纳米材料能否进行生物应用以及能否实现肿瘤杀伤作用的基础。非载药纳米探针对正常细胞的细胞毒性实验结果显示(图6)，与正常细胞孵育24h后，正常细胞活力较高(表4)，即使在200μg/ml的浓度下，muvec和htert-hpne细胞的存活率高于90％。且正常细胞与肿瘤细胞相比细胞活力存在明显差异(p<0.01)；如图7a所示，mfc-gem细胞活力结果显示，随着mfc-gem浓度的增加，panc02细胞活力明显降低。相对于单独使用gem而言在mfc-gem组中，panc02的细胞活力下降更加明显，在相同gem浓度下mfc-gem显示出对肿瘤细胞更高的抑制效果(表5)。两者统计学分析结果(表6)表明，两种处理结果之间具有显著的统计学差异(p<0.001)。此外，ic50结果显示gem组的半最大抑制浓度(ic50＝30.46nm)比panc02细胞的mfc-gem(ic50＝5.99nm)高5倍(图7b)。以上结果表明，mfc能显著增强gem对panc02的抑制作用，同时代对正常细胞具有良好的生物相容性和可忽略的细胞毒性。
表4mfc对细胞活力的影响结果
注：每组实验重复5次
表5经mfc处理后肿瘤细胞与正常细胞的细胞活力统计学分析
注：p<0.01：具有明显差异。正常细胞：muvec、htert-hpne；肿瘤细胞：panc02。
表6gem与mfc-gem对panc02细胞活力影响的统计学分析
注：p<0.001：具有显著差异。
2.2mfc-gem在体内的h2o2和gsh催化特性
2.2.1细胞内h2o2水平：为了证实mfc在消耗h2o2生成·oh的催化活性，本发明用dcfh-da作为细胞内ros探针，评价了mfc-gem对细胞内氧化应激的影响。如图7d所示，经过mfc-gem处理的panc02细胞比gem和对照组相比显示出更强的dcf荧光信号。此外通过使用铁螯合剂去铁胺甲磺酸(dfo)作为阴性对照处理细胞后，结果显示，经dfo处理后mfc组的绿色荧光强度发生下降。这进一步提示，纳米探针主要通过fe催化panc02细胞内h2o2，实现ros含量的增高。
2.2.2细胞内gsh水平：证实mfc-gem对肿瘤细胞内gsh含量的影响，使用gsh检测试剂盒评估了肿瘤细胞内gsh水平。如图7c所示，经gem处理的后panc02细胞内gsh含量未显示出明显下降(93.2±5.10％)且与对照组相比(表7)无统计学差异(p>0.05)，而mfc与mfc-gem组panc02中的gsh含量分别下降，分别为30.8±6.31％和23.9±2.80％，统计结果显示(表7)，经mfc-gem处理后细胞内gsh水平与对照组之间存在显著差异(p<0.001)。更重要的是，mfc-gem和mfc组panc02细胞内的gsh水平比使用gsh清除剂n-乙基马来酰亚胺(n-ethylmaleimide，nem)处理的gsh含量更低，这进一步说明，mfc-gem的能够显著消耗肿瘤细胞内的gsh含量。
表7不同处理对panc02细胞内gsh水平的影响
注：每组实验重复3次，gsh含量＝(实验组/control组)×100％；p>0.05，无统计学差异；p<0.001存在显著差异。
2.3肿瘤细胞内lipidros和线粒体膜电位水平(δψm)
2.3.1lipidros水平：为研究纳米探针对肿瘤内lipidros产生的影响，利用c11bodipy581/591的荧光探针验证了细胞内lipidros水平。结果显示经mfc和mfc-gem处理后panc02细胞内荧光探针从红色荧光变为绿色荧光(图8a)。这说明，经mfc-gem处理后panc02细胞内lipidros水平升高。为了进一步探究mfc-gem对lipidros的作用，经lipidros抑制剂fer-1预处理细胞后，mfc-gem引起的绿色荧光强度明显下降。这进一步证实，mfc和mfc-gem能够促进panco2细胞内lipidros的产生和积累，且mfc-gem的这种作用更强一些。
2.3.2δψm水平
用jc-1荧光探针监测经mfc，gem和mfc-gem刺激后panc02的δψm变化，结果显示(如图8b)，经mfc，gem处理后panc02胞质内产生绿色荧光，尤其经mfc-gem处理后细胞内更是呈现出明显的绿色荧光，对照组则未观察到明显的绿色荧光。
2.3.3超氧阴离子(superoxideanion，o2·-)水平
2.4mfc-gem体外治疗效果与机制
2.4.1活/死细胞染色结果：为评价mfc-gem的治疗效果，通过calcein-am/pi染色对肿瘤活细胞和死亡细胞进行染色。结果表明(如图9a)，在与mfc-gem孵育后大量panc02细胞显示出红色荧光。然而，在相同的gem和mfc浓度处理下，仅部分panc02细胞显示出红色荧光，这说明与mfc和单纯使用gem处理肿瘤细胞相比，mfc-gem对panc02细胞的杀伤作用更加明显。这一结果与cck-8引起的细胞活力的降低结果相一致。
2.4.2流式细胞术结果：为进一步研究mfc-gem对胰腺癌细胞的杀伤作用，通过流式细胞术对panc02细胞的凋亡坏死水平进行检测。其检测结果显示(图9b)，经annexinv-fitc/pi处理后，经gem处理的panc02细胞可以呈现出一定的凋亡水平，而mfc-gem处理后显示panc02细胞凋亡和坏死细胞的比例明显的增加。这一结果与calcein-am/pi染色结果一致。以上结果说明mfc与gem在本发明所述给药系统中的联用能够提高肿瘤的杀伤作用，促进治疗效果。
表8panc02细胞相对蛋白表达量
2.4.4线粒体形态学变化：当细胞发生铁死亡时线粒体会发生与其他细胞死亡形式显著不同的变化。因此，线粒体形态学的改变可以作为肿瘤细胞是否发生铁死亡的重要依据。研究表明，erastin能够诱导细胞发生体死亡，并作为细胞发生铁死亡的阳性对照。经mfc-gem处理后tem观察结果显示(图9e和9f)，经mfc，mfc-gem处理后panc02细胞内线粒体膜密度增加，线粒体的体积减少，线粒体脊消失，这种现象mfc-gem相较于mfc更为显著。这与erastin处理的panc02细胞形态学变化结果一致。这表明mfc和mfc-gem能够导致panc02细胞发生铁死亡。同时，在gem和mfc-gem处理的细胞中可以观察到panc02细胞核染色质皱缩和边缘化，这表明mfc-gem可同步诱导panc02细胞发生铁死亡和凋亡。
3mfc-gem的体内影响
3.1mfc-gem体内分布和生物安全性
纳米材料的生物分布和系统毒性是纳米材料能否进行生物医学应用的关键。尽管本发明在研究中已经证实了mfc-gem在肿瘤细胞中具有较高的生物安全性，但仍需进一步探究其在动物的体内分布和潜在毒性。
3.1.1mfc-gem的体内分布
为了评估mfc-gem的体内分布，荷panc02肿瘤小鼠尾静脉注射mfc-gem后的icp-ms结果显示(图10a)，由于网状内皮系统的捕获，fe和mn主要分布在小鼠的脾脏和肝脏。注射前后肿瘤组织对fe和mn的摄取分别为8.86±0.99μg/g和71.52±6.72μg/g，3.24±0.76μg/g和32.03±9.97μg/g(表9)。这说明，mfc-gem能够通过epr效应在肿瘤组织中得到了有效的积累，使其适合于体内抗胰腺癌治疗，同时有利于mr的体内成像。
表9尾静脉注射前、后，荷瘤小鼠组织、器官内fe、mn元素的分布
3.1.2mfc-gem的系统毒性
为了评估mfc-gem的系统毒性，通过溶血实验证实(图10b和10c)，mfc-gem的质量浓度达到200μg/ml，红细胞溶血率仍小于5％。为了进一步验证mfc-gem对小鼠器官的影响，通过对panc02荷瘤balb/c小鼠静脉尾静脉注射gem，mfc和mfc-gem，获取主要器官，h&e染色后进行组织学评估，如图10d所示，在主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)中没有观察到明显的损伤或炎症病变，这意味着mfc-gem在体内的毒性可以忽略不计。为进一步探究mfc-gem对小鼠机体生理功能的影响，进行了相应的生化和全血检测(图11)。其中主要生化指标，肝功能：丙氨酸转氨酶标(alt)、天冬氨酸转氨酶(asl)以及肾功能指标：血尿素氮(bun)、肌酐(crl)与对照组相比均在正常范围内波动。全血指标检测：红细胞(rbc)，白细胞(wbc)，血红蛋白(hgb)，血小板(plt)，血细胞比容(hct)，平均红细胞体积(mcv)，平均红细胞血红蛋白(mch)和平均红细胞血红蛋白浓度(mchc)，与正常对照组相比，注射mfc-gem的小鼠所有检测指标基本处于正常范围。以上结果表明，mfc-gem主要分布于肝脏和脾脏中，同时能够被肿瘤组织所摄取，且对肝脏和肾脏功能没有明显的影响，具有较高的生物相容性和较低的系统毒性。
4实时mr诊断能力
4.1细胞mr成像
表10panc02摄取纳米探针后mr信号强度变化(si孵育前/si孵育后×100％)
4.2荷瘤小鼠mr成像
为进一步评价纳米探针在小鼠体内的mr成像能力。对panc02荷瘤balb/c小鼠尾静脉注射mfc-gem后的mr成像结果表明(图14a)：在注射后0.5h，t2加权图像显示出肿瘤区域开始呈现对比差异，在注射4h后显示出明显的信号对比效果，其信号强度下降为注射前的54.68％±1.19(表11)，这种对比差异在接下来的12h内逐渐减少(图14b和14d)。对标本肿瘤切片进行普鲁士蓝染色结果显示(图14c)，普鲁士蓝染色肿瘤组织中呈现明显的蓝色沉积证实mfc-gem可以有效地进入肿瘤组织。
表11尾静脉注射前、后小鼠肿瘤组织mr信号强度(si孵育前/si孵育后×100％)
5mfc-gem体内治疗机制与效果
5.1体内治疗机制
受体外mfc-gem对胰腺癌治疗效果的启发，为进一步探究mfc-gem在体内肿瘤的疗效和机制，通过按时对荷瘤小鼠尾静脉注射生理盐水；gem(200μl，178μg/kg)；mfc(200μl，5mg/kg)及mfc-gem(200μl，5mg/kg)，研究mfc-gem在体内的肿瘤治疗效果和机制(图14a)。免疫组织荧光染色分析治疗后肿瘤组织内gpx4和caspase-3的表达，如图15a显示，经mfc-gem处理后小鼠肿瘤组织内gpx4表达量下降。同时与单纯使用gem和mfc组相比，mfc-gem组caspase-3表达水平显著提高。这表明mfc-gem能够在小鼠体内诱发肿瘤细胞发生铁死亡进而促进gem的凋亡作用。随后，为了进一步证实mfc-gem治疗效果，通过tunel和h&e染色显示，mfc-gem处理的小鼠肿瘤内部出现明显的细胞死亡，肿瘤组织内部出现大片的坏死，组织和细胞结构紊乱、碎裂。
5.1体内治疗效果
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。