宁军号1、2,秦宇博3,胡伦超1,张伟杰1,李磊1,常亚青1,宋坚1(1.大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室,辽宁大连116023;2.中国科学院海洋研究所实验海洋生物学重点实验室,山东青岛266071;3.辽宁省海洋环境预报与防灾减灾中心,辽宁沈阳110001)
关键词：褐篮子鱼;低温胁迫;血清酶;生化指标
水温是影响鱼类生存、分布的重要生态因子,水温变化可引起鱼类生理机能、激素水平、抗氧化能力、免疫功能、血液学和血清生化指标的改变。研究表明,温度骤降(acutetemperature)和冷驯化(coldacclimation)是研究水产动物抗寒性能的有效手段[1-3],两者均属低温胁迫。当鱼类受到低温胁迫时,首先试图通过自我调节适应低温环境;若低温胁迫超出鱼类承受能力,鱼体内稳态将发生不可逆改变,最终导致死亡。鱼类血液参与机体的营养运输、物质代谢、免疫调控过程,在受到外在胁迫时,机体神经-体液调节和组细胞代谢将发生改变,并首先反映在血液学和血清生化指标中[4-5]。因此,研究低温胁迫对鱼类血液学和血清生化指标的影响具有重要的意义。
1.1材料
试验用鱼于2015年11月取自大连湾室内养殖场越冬苗,在同一池塘内挑选规格均匀、健康无伤的褐篮子鱼160尾,体长为(12.62依0.50)cm,体质量为(37.12依5.60)g。充气后运回实验室暂养,暂养密度为40尾/m3,水温为(24.0依0.5)益,盐度为32.20,pH为8.05,溶解氧大于6mg/L。暂养期间每天8:00、20:00各投喂新鲜石莼、裙带菜Undariapinnatifida1次,投喂1h后吸出残饵并换水,换水量为总水量的20%。
1.2方法
1.2.1低温胁迫试验设计降温模式是根据常玉梅等[2]和陈超等[3]的方法稍加修改。将试验鱼放入水温(24.0依0.5)益的控温循环水槽(180cm伊100cm伊70cm)中,暂养7d后进行低温胁迫试验。降温前,水温缓、骤降试验组分别在24益控温水槽中随机捞取6尾鱼采血作为对照组。
(1)水温骤降试验。将暂养在水温24益水槽中的50尾试验鱼捞出直接放入20益控温循环水槽中(事先调好水温并充气),适应1h后随机抽取6尾鱼采血,将剩余试验鱼在20益控温水槽中维持24h后,直接将试验鱼捞出放入水温16益的控温水槽中,适应1h后随机取6尾鱼采血,以此类推,直至将剩余试验鱼放入8益适应1h后随机取6尾鱼采血,每个温度组分别取3个平行全血、血清血样。取样后仍存留的试验鱼少量投喂,并在投喂2h后吸出食物及残渣。
(2)水温缓降试验。取80尾试验鱼放入控温水槽中进行水温缓降试验。水温缓降模式如下:初始水温为24益,按1益/3h的降温速度调节至设定温度,每降4益(分别在20、16、12、8益)维持3d,每个温度下随机抽取6尾试验鱼采血,每个温度组分别取3个平行全血、血清血样。试验过程中记录试验鱼摄食、死亡情况。取样前24h停止投饵,试验鱼取样后按暂养期间方式投喂。
1.2.2血液采集及指标测定
(2)血清生化指标。将剩余的1.0mL血液注入灭菌离心管中(1.5mL),放在冰盘上静置5~6h后,以3000r/min离心10min,收集血清。采用全自动生化分析仪(迈瑞BS-2000M,中国),测定葡萄糖(GLU)、胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、碱性磷酸酶(AKP)、尿素氮(BUN)和肌酐(CREA)等生化指标。所有样品均当天测定完成。
1.3数据处理
试验数据经Excel2007软件初步处理后,采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析,使用Duncan法进行多重比较,数据均以平均值依标准误(mean依S.E.)表示。
2.1褐篮子鱼对低温胁迫的反应
试验中,当水温从24益骤降或缓降至20益时,试验鱼均未出现任何不良反应,游动自如,快速规避,摄食强度与对照组无明显差别;当水温降至16益和12益时,试验鱼大多聚堆,躲在控温水槽角落或遮蔽物(循环泵)处,骤降组试验鱼几乎停止摄食,缓降组试验鱼摄食强度下降;当水温由12益骤降至8益时,骤降组试验鱼开始异常活跃,在水中快速游动或跳出水面,表现出极度不适应,30min后,绝大多数试验鱼横躺水槽底部,刺激水槽可做冲刺式游动,3h后出现死亡个体;当水温缓降至11益时,缓降组试验鱼仍可少量摄食,水温缓降至10益,试验鱼开始成群游动,停止摄食,刺激仍能较快反应,水温缓降至9益时,缓降组试验鱼的应激反应与骤降至8益时的试验鱼表现相似,开始出现死亡现象。
2.2温度骤降对褐篮子鱼血液生理指标的影响
从表1可见:水温骤降对试验鱼血液中RBC、Hct、MCV、HGB和MCHC均有显著影响(P<0.05);水温骤降至8益时,RBC、HGB、Hct含量较对照组(24h)均显著下降(P<0.05),其他指标则随水温骤降呈波动变化,但在水温降到8益时,均恢复至初始水平(P>0.05)。
表1温度骤降胁迫下褐篮子鱼血液指标在3个温控点的比较Tab.1ComparisonofbloodindicesofduskrabbitfishSiganusfuscescensexposedtosuddendecreaseintemperatureat3controltemperatures
注:同列中标有不同小写字母者表示组间有显著性差异(P<0.05),标有相同小写字母者表示组间无显著性差异(P>0.05),下同Note:Themeanswithdifferentletterswithinthesamecolumnaresignificantdifferencesatthe0.05probabilitylevel,andthemeanswiththesameletterswithinthesamecolumnarenotsignificantdifferences,etsequentia
温控点/益temperature白细胞/(109cells·L-1)WBC红细胞/(1012cells·L-1)RBC血红蛋白/(g·L-1)HGB红细胞压积/(g·L-1)Hct红细胞平均体积/fLMCV红细胞平均血红蛋白含量/pgMCH红细胞平均血红蛋白浓度/(g·L-1)MCHC24(对照)143.33依31.151.79依0.08a36.53依3.38a0.22依0.01a123.19依2.33b18.62依0.82141.87依0.67a16183.57依9.621.33依0.13b20.87依10.04ab0.21依0.02a159.22依0.99a14.59依6.8491.27依4.26b8120.50依30.070.65依0.05c13.53依1.45b0.08依0.01b128.28依1.02b20.55依0.85161.20依8.39a
图1温度骤降胁迫下褐篮子鱼血清的酶活力Fig.1SerumenzymeactivitiesindustrabbitfishSiga-nusfuscessensexposedtosharpdecreaseinwa-tertemperature
注:标有不同小写字母者表示组间有显著性差异(P<0.05),标有相同小写字母者表示组间无显著性差异(P>0.05),下同Note:Themeanswithdifferentlettersaresignificantdifferencesatthe0.05probabilitylevel,andthemeanswiththesamelettersarenotsignificantdifferences,etsequentia
2.3温度骤降对褐篮子鱼血清生化指标的影响
从图1可见:褐篮子鱼血清ALT活力呈先升后降趋势,水温骤降至16益以下时,ALT活力均显著高于对照组(P<0.05),且在12益时达到最大值(P<0.05);AST活力则随水温骤降呈波动变化且显著高于对照组(P<0.05),AST活力亦在水温降至12益时达到最大值;AKP活力呈先升后降趋势,在水温降至20益时显著上升并达到最大值(P<0.05),其他控温组与对照组均无显著性差异(P>0.05)。
从图2可见,除血清BUN水平外,水温骤降对褐篮子鱼血清生化指标均有显著性影响(P<0.05)。其中,GLU含量在水温降至20益时显著低于对照组(P<0.05),随后GLU含量维持不显著水平至12益,水温骤降至8益时,GLU含量达到最大值,且显著高于对照组(P<0.05);CHOL、TP、ALB含量在水温降至20益时可维持初始水平,水温降至16益时显著低于对照组(P<0.05),并维持此低水平至试验结束;TG、CREA含量在水温降至20益时显著高于对照组(P<0.05),水温降至16益时显著降低(P<0.05),随后维持最低水平至试验结束。
2.4温度缓降对褐篮子鱼血液生理指标的影响
从表2可见,水温缓降模式亦可引起褐篮子鱼血液学指标发生变化,但不如水温骤降模式变化剧烈。其中,WBC、RBC、HGB3个指标在水温降至16益和8益时,均显著低于对照组(P<0.05),其余指标均无显著性变化(P>0.05),且除MCH略有上升趋势外,其余指标均呈波动变化。
图2温度骤降胁迫下褐篮子鱼血清的生化指标Fig.2SerumbiochemicalindicesindustrabbitfishSi-ganusfuscescensexposedtosharpdecreaseinwatertemperature
表2温度缓降胁迫下褐篮子鱼血液指标在3个温控点的比较Tab.2ComparisonofbloodindicesofdustrabbitfishSi-ganusfuscescensexposedtogradualdereaseintemperatureat3controltemperatures
温控点/益temperature白细胞/(109cells·L-1)WBC红细胞/(1012cells·L-1)RBC血红蛋白/(g·L-1)HGB红细胞压积/(g·L-1)Hct24143.33依31.15a1.79依0.08a36.53依3.38a0.22依0.0116100.73依29.52b1.22依0.19b24.53依4.06b0.15依0.03894.33依22.81b1.21依0.06b24.53依0.33b0.18依0.01温控点/益temperature红细胞平均体积/fLMCV红细胞平均血红蛋白含量/pgMCH红细胞平均血红蛋白浓度/(g·L-1)MCHC24123.19依2.3318.62依0.82141.87依0.6716121.03依8.5519.80依1.28165.33依14.288145.10依13.4020.13依0.90140.67依10.52
2.5温度缓降对褐篮子鱼血清生化指标的影响
从图3可见,水温缓降模式对褐篮子鱼血清代谢酶均有显著影响(P<0.05)。其中,ALT活力呈先缓升再缓降趋势,在水温降至12益时,其活力显著高于对照组(P<0.05),并达到最大值;AST活力在水温缓降胁迫中呈波动变化,其活力分别在水温降至20益和12益时显著高于对照组(P<0.05);AKP活力呈波动变化,其活力分别在水温降至20、12、8益时显著高于对照组(P<0.05)。
从图4可见,水温缓降模式对褐篮子鱼血清生化指标均有显著影响(P<0.05)。其中,GLU含量维持初始水平至12益(P>0.05),水温缓降至8益时显著高于对照组(P<0.05);CHOL含量呈先降后升趋势,其含量在水温降至16益和12益时显著低于对照组(P<0.05);TG、TP和CREA含量呈先升后降趋势,在水温降至20益时显著高于对照组(P<0.05),随后降低并维持低水平至试验结束;ALB含量在水温缓降至16益以下时显著降低(P<0.05),并维持该水平至试验结束;BUN含量在水温缓降胁迫中波动变化,但与对照组无显著性差异(P>0.05)。
图3温度缓降胁迫下褐篮子鱼血清的酶活力Fig.3SerumenzymeactivitiesindustrabbitfishSiga-nusfuscescensexposedtogradualdereaseinwa-tertemperature
图4温度缓降胁迫下褐篮子鱼血清的生化指标Fig.4SerumbiochemicalindicesindustrabbitfishSi-ganusfuscescensexposedtogradualdereaseinwatertemperature
3.1降温模式对褐篮子鱼行为的影响
3.2降温模式对褐篮子鱼血清代谢酶活力的影响
鱼类血清酶活力高低与相应组织器官代谢水平和功能状态有关,其变化可间接反映组织器官的功能状态变化[3,14]。血清ALT和AST常作为肝脏代谢过程中受损伤程度的两种重要酶[15-16]。正常情况下,ALT在血清中含量较少,其在肝细胞中含量较高;AST在维持心肌正常生理功能方面有重要作用,临床上常用于检测心肌功能指标[3]。本研究中,水温骤降模式中除ALT在20益外,血清ALT和AST含量均发生显著升高,表明褐篮子鱼在温度骤降过程中肝脏正常代谢发生异常,肝细胞中ALT释放到血液中引起血清ALT活力升高。这与低温胁迫对七带石斑鱼Epinephelusseptemfasciatus[3]和吉富罗非鱼GIFTOreochromisniloticus[14]血清生化指标的研究结果一致。血清AST活力升高可能是心肌细胞正常生理功能受损或通透性增加的结果[4]。水温缓降模式中,褐篮子鱼血清ALT和AST活力在降温过程中均有显著升高,在试验结束时均恢复至初始水平,表明低温驯化已对试验鱼肝脏、心肌正常生理功能造成一定损伤,鱼体通过自身调节或强烈应激产生应答,这对褐篮子鱼的引种工作具有重要意义。
3.3降温模式对褐篮子鱼血清葡萄糖、总蛋白、甘油三酯等生化指标的影响
甘油三酯是细胞膜的重要组分,也是动物细胞贮存脂肪的主要形式。本研究中,两种降温模式中试验鱼血清TG含量均呈先升后降趋势,不同之处为水温缓降模式中血清TG在试验结束时能恢复到初始水平。血清TG水平升高可能是皮质醇在低温胁迫时升高加速脂肪代谢的结果[14],TG含量增加亦有利于鱼类应激御寒。关于血清TG水平降低,常玉梅等[22]研究认为,低温引起肝细胞功能障碍,阻碍了TG通过肠肝循环进入肝脏的重吸收作用,而使血清中TG水平下降。本研究水温缓降模式中血清TG可恢复至初始水平,陈超等[3]解释为受低温胁迫后鱼类的一种应激反应,试验鱼开始动用体内贮存脂肪来维持生存代谢。
血清蛋白参与鱼类各种生理活动,在鱼类低温应激过程中起重要调节作用[4]。本研究中,血清TP和ALB含量在水温骤降模式中均呈先维持后显著降低的趋势,试验结束时达最低值,表明温度骤降对褐篮子鱼造成极大伤害,肝脏功能障碍降低或失去了合成蛋白能力。与此同时,水温骤降模式下褐篮子鱼停止摄食也可能是造成血清蛋白下降的原因之一。陈超等[3]研究低温对七带石斑鱼幼鱼血清生化指标的影响中得出了相似结论。本研究水温缓降模式中,试验鱼血清TP水平呈先升后降的变化,表明褐篮子鱼对水温缓降驯化存在积极的应激反应,通过提高血清TP含量以适应外界低温环境。Ning等[1]研究温度缓降和骤降对刺参Apos-tichopusjaponicus的胁迫效应时认为,温度缓降过程中刺参体内可溶性蛋白含量先升后降的变化是在积极响应水温缓降胁迫,与本研究结果相一致。
血清尿素氮是蛋白质代谢产物之一,可作为一种衡量鱼类肾功能代谢的指标,较低的血清BUN水平表明机体蛋白合成效率高[23]。本研究中,与初始水平相比,水温缓、骤降并没有引起褐篮子鱼血清BUN含量的显著变化,表明褐篮子鱼体内BUN代谢较为正常。
综上所述,两种降温模式均对褐篮子鱼血液和血清生化指标有显著影响,水温骤降比缓降对褐篮子鱼造成的伤害更大,甚至有些伤害是不可逆的,如温度骤降模式中TG、TP、CREA、ALB等指标发生不可逆降低。因此,褐篮子鱼低温驯化过程中应尽量避免水温骤降带来的危害。本研究中,褐篮子鱼能够存活的最低温度为12益,8~9益是褐篮子鱼致死的低温极限,褐篮子鱼引种过程中应注意上述关键控温点并优选大规格鱼驯化引种。考虑到温度骤降影响褐篮子鱼的摄食活动,建议对褐篮子鱼进行低温驯化时降温幅度不应超过4益,且降温速率不宜过快。
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EffectsofabruptandgradualdecreasesinwatertemperatureonbloodphysiologicalandbiochemicalparametersindustyrabbitfishSiganusfuscescens
NINGJun-hao1,2,QINYu-bo3,HULun-chao1,ZHANGWei-jie1,LILie1,CHANGYa-qing1,SONGJian1(1.KeyLaboratoryofMariculture&StockEnhancementinNorthChina蒺sSea,MinistryofAgriculture,DalianOceanUniversity,Dalian116023,China;2.KeyLaboratoryofExperimentalMarineBiology,InstituteofOceanology,ChineseAcademyofSciences,Qingdao266071,China;3.LiaoningProv-inceMarineEnvironmentalForecastingCenter,Shenyang110001,China)
Keywords：Siganusfuscescens;low-temperaturestress;serumenzyme;biochemicalparameter
中图分类号：S968.1
文献标志码：A
DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.03.007
收稿日期：2016-07-27
基金项目：辽宁省科技攻关重大项目(2015203003)
作者简介：宁军号(1988—),男,博士研究生。E-mail:ningjunhaook@126.com
通信作者：宋坚(1971—),男,研究员。E-mail:dlmel@163.com