本发明涉及医药领域，特别涉及一种SD大鼠临床检验方法。
背景技术：
毒性试验为给实验动物进行不同途径、不同期限的染毒、检测各种毒性终点的实验，其目的是确定无害作用水平、毒性类型、靶器官、剂量-反应关系，为安全性评价或危险性评价提供重要的资料。
长期毒性试验为在急性毒性试验结果的基础上，观察评价动物反复给予受试物后，机体产生毒性反应的特征及其毒性损害的严重程度，以及主要毒性靶器官及其损害的可逆性。
受试物长期毒性试验的目的是提供受试物的无毒性反应剂量和临床主要检测指标，为制定人用安全剂量提供参考资料。一种好的长期毒性试验方法，可推动毒性试验方法的统一和规范化，获得符合管理部门所需毒性资料。
技术实现要素：
为此，发明人提供一种适合长期毒性研究的SD大鼠临床检验方法。为实现上述目的，发明人提供了一种SD大鼠临床检验方法，包括以下步骤：
SD大鼠给药试验结束后，SD大鼠禁食12～16小时后灌胃2％的戊巴比妥钠生理盐水溶液进行麻醉，从心脏采血完毕后处死后进行解剖；检测血液、血清的生化指标并对解剖后的器官或组织进行称重和病理组织学检查。
进一步地，所述血液生化指标包括红细胞计数、血红蛋白定量、红细胞比积、血小板计数、白细胞计数、中性粒细胞定量、淋巴细胞定量、单核细胞定量、嗜酸性粒细胞定量、网织红细胞计数。
进一步地，所述血清生化指标包括丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、尿素、肌酐、总蛋白、白蛋白、葡萄糖、总胆固醇、甘油三脂。
进一步地，所述SD大鼠进行称量重量的组织器官包括：心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、脑、肾上腺、睾丸、卵巢。
进一步地，所述SD大鼠进行病理组织学检查的组织器官包括：脑、心脏、肺、肝脏、肾脏、脾脏、胃、小肠、大肠、睾丸、卵巢、肾上腺。
进一步地，所述病理组织学检查包括以下步骤：将组织器官进行固定，固定后的组织经修块取材，逐级酒精脱水石蜡包埋轮转式切片，经苏木素-伊红染色，光镜下进行检查。
进一步地，所述HE染色步骤包括：将病理切片置于65℃烘箱中5min,将切片置于二甲苯中两次进行脱蜡，酒精梯度脱去二甲苯。苏木素染色6min,清水冲洗2min后，梯度乙醇依次脱水，伊红染色2min,无水乙醇浸泡3min后再置于二甲苯中浸泡3min,中性树胶封片。
进一步地，进行临床检验的SD大鼠毒性培育方式包括：给药方式为连续灌胃，其中健康SD大鼠按体重随机分为4组：溶媒对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组数量相同，雌雄各半；
低、中、高剂量组给药剂量分别为500、1500、4500mg/kg大鼠，溶媒对照组灌胃0.2％CMC-Na，给药容量均为10ml/kg大鼠；
所述溶媒由CMC-Na用去离子水配置，为质量百分比为0.2％的CMC-Na溶液；
所述低剂量组、中剂量组、高剂量组，为溶媒溶解待检测药剂，配置浓度分别为50mg/ml、150mg/ml、450mg/ml。
区别于现有技术，上述技术方案提供了一种新的SD大鼠临床检验方法，对进行长期毒性试验的SD大鼠进行临床检验，该检验方法稳定有效，通过观察供试品对实验动物产生的毒性反应及其严重程度、主要毒性靶器官及损害的可逆程度，可有效的提供无毒性反应剂量，为临床设计人用剂量和主要观察指标提供参考。
附图说明：
图1胜培元灌胃雌性大鼠体重的变化,
图2胜培元灌胃雄性大鼠体重的变化,
图3胜培元灌胃雌性大鼠食量的变化,
图4胜培元灌胃雄性大鼠食量的变化,
图5胜培元灌胃雌性大鼠血常规的变化,
图6胜培元灌胃雄性大鼠血常规的变化,
图7胜培元灌胃雌性大鼠血生化的变化,
图8胜培元灌胃雄性大鼠血生化的变化,
图9胜培元灌胃雌性大鼠主要脏器的绝对重量的变化,
图10胜培元灌胃雄性大鼠主要脏器的绝对重量的变化,
图11胜培元灌胃雌性大鼠主要脏器的相对重量的变化,
图12胜培元灌胃雄性大鼠主要脏器的相对重量的变化，
图13胜培元灌胃给药对SD大鼠30天毒性实验肝脏组织图片，
图14胜培元灌胃给药对SD大鼠30天毒性实验睾丸组织图片，
图15胜培元灌胃给药对SD大鼠30天毒性实验卵巢组织图片，
图16胜培元灌胃给药对SD大鼠30天毒性实验肾上腺组织图片，
图17胜培元灌胃给药对SD大鼠30天毒性实验肾脏组织图片，
图18胜培元灌胃给药对SD大鼠30天毒性实验肺组织图片，
图19胜培元灌胃给药对SD大鼠30天毒性实验小肠组织图片，
图20胜培元灌胃给药对SD大鼠30天毒性实验大肠组织图片，
图21胜培元灌胃给药对SD大鼠30天毒性实验脑组织图片，
图22胜培元灌胃给药对SD大鼠30天毒性实验脾组织图片，
图23胜培元灌胃给药对SD大鼠30天毒性实验心脏组织图片。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
本实施方式中用于试验的产品为甘诺宝力牌胜培元胶囊(以下简称“胜培元”)。
实施例：用胜培元进行30天毒性试验的SD大鼠进行临床检验
1、供试品：胜培元，胶囊(450mg/粒)
2溶媒
2.1溶媒
名称：CMC-Na
性状：类白色粉末
批号：B326BA0713
提供单位：上海生物工程股份有限公司；
保存：2～8℃保存；
配制方法：用去离子水配制成0.2％CMC-Na溶液。
2.2供试品配制方法
用溶媒配制成所需浓度
2.3剩余供试品的处理
对于没有开封的供试品全部返还委托方；已经开封配制使用后剩余的供试品进行废弃处理，并进行登记，由实验动物中心统一处理。
2.4主要试剂
名称：戊巴比妥钠；
性状：棕黄色粉末；
有效期：开封后3年有效(开封日期：2015.05.25)；
提供单位：Bio-L灌胃HTBIOTECH；
保存：室温保存；
配制方法：用0.9％氯化钠配制成0.2％的戊巴比妥钠生理盐水溶液。
3试验动物
3.1试验系统及选择理由
SD大鼠国内外背景资料丰富，动物供应充足；
3.2种系、质量
SD大鼠，普通级；
由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供；
3.4实验动物资料
实验动物质量合格证号：2008001660398，序号：024811，由上海西普尔-必凯试验动物有限公司提供；实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2013-0016，由上海市科学技术委员会签发；动物接收日期：2016年05月10日；
3.5试验动物数
动物订购数量：雄性：40只；雌性：40只；动物接收数量：雄性41只，雌性42只；试验用动物数：80只；雌雄各半；选择体重符合要求的动物进行试验，分组后剩余的动物移交给实验动物管理室负责处理。
3.6试验开始(分组)时年龄
4周龄；
3.7试验开始(分组)时体重
雌性：88.6～102.3g，雄性：78.9～102.4g。
3.8检疫
检疫内容：
(1)动物外观健康检查：从外观体征、行为活动、排泄物性状等方面观察动物的一般状态有无异常。
(2)动物微生物检查—动物体内外寄生虫检查，体内细菌、病毒检查
本试验所用动物来自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，此检查已在实验动物有限公司完成，因此除非观察到动物有明显的感染症状，在检疫观察期不再进行该项检查。
4动物分组及识别
4.1组数
共分4组，分别为：溶媒对照组、低剂量组(500mg/kg)、中剂量组(1500mg/kg)、高剂量组(4500mg/kg)。
4.2各组动物数
4.3分组方法
根据检疫、环境适应和饲养结束的最后一次体重，按体重随机分组法分组；
雌、雄分别分组。
4.4试验动物的标记方法
被毛涂色标号进行区分。
4.5试验笼子的标记方法
分组后，用标签进行组别区分，标签上应注明课题编号、药物名称、给药剂量、动物号、实验人员和实验日期等。
5实验动物饲养、管理的环境和条件
5.1环境条件
饲养房间温湿度：温度：22.2～23.7℃，湿度：56.0～58.8％；
换气次数：20次以上/小时；
清扫及消毒：全部作业结束后清扫，而后由动物管理室进行消毒。用爱尔施牌消毒片、84消毒液和新洁尔灭进行轮换消毒，每周一次轮流交换消毒液种类。
5.2饲养条件
饲养鼠盒种类：不锈钢金属笼(L×W×H：300×400×210mm)；
饲养密度：检疫期5～6只/笼，分组给药后5只/笼；
粪托盒更换频度：1次/2天。
5.3饲料
订购：饲料由实验动物管理室向饲料生产厂家订购，饲料到达后进行核收；
种类：为SPF级生长鼠料(辐照灭菌)；
产品标准编号：Q3201XT04-2015；
制造单位：江苏省协同医药生物工程有限公司；
饲料主要成分检测：主要成分包括水分、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、钙、总磷等，由饲料供应商提供检测结果的原件或复印件，每个批号提供。实验动物中心每年至少送检一次；
饲料污染物含量检测：污染物指标包括砷、铅、镉、汞、六六六、滴滴涕、菌落总数、沙门氏菌等；污染物的检测采用本机构送检和饲料提供单位提供检测报告相结合，本机构每年至少送检一次，饲料提供单位每年至少提供一次检测结果的原件或复印件；
饲料的保存：饲料保存在专门的饲料间里，温度≤26℃，湿度≤70％；
试验中所使用饲料批号：20160310；
保质期：12个月。
种类：过滤水(高压蒸汽灭菌后)；
供水方法：由动物饮水瓶自由摄取；
饮用水的检测：参照中华人民共和国国家标准GB/T5750-2006，实验动物中心每6个月检测一次。检测结果符合规定。
6试验方法
6.1剂量设计
SD大鼠连续灌胃30天4500mg/kg/d、1500mg/kg/d、500mg/kg/d3个剂量组各给予10只SD大鼠，雌雄各半，动物未见明显异常。设低、中、高三个给药组及溶媒对照组。观察动物毒性反应、毒性严重程度及其可恢复性，为临床研究提供参考。
每天上午10:00给药一次，连续给药30天。
6.3给药途径
临床拟用给药途径为口服给药，鉴于啮齿类动物口服给药的特殊性，在本动物试验中选择灌胃给药，灌胃针头孔径规格18号。
6.4组别构成和解剖日期见下表
7试验操作、检查和测定
7.1一般症状的观察
观察时程和次数：从购入动物日到恢复期结束每日上午10:00、下午16:00进行观察；
观察例数：全部动物；
观察方法：隔笼观察。
观察内容：从外观体征、行为活动、排泄物性状、给药局部反应等方面观察动物的一般状态有无异常；
7.2体重测定
测定次数：检疫观察期第l天，检疫观察期结束、给药开始后每周1次进行体重测定；另外，在解剖前先测定动物的体重；
例数：全部动物；
测定方法：用电子天平进行体重测定；
7.3摄食量测定
测定次数：第一次给药前测定进食量一次，而后每2天1次进行摄食量测定；
例数：全部试验动物；
测定方法：每组雌雄动物第一天分别给予定量饲料，第三天分别测定剩余饲料量，以二者的差计算每组雌雄动物的48小时进食量，并计算每只动物的平均进食量。
7.4采血
采血次数：各组动物在解剖时采血；
例数：濒死以及预定解剖的全部动物在解剖前采血，进行血常规和血清
生化检测；
方法：在采血前(剖检前)12～16小时禁食，自由饮水，麻醉后心脏取血。
对于濒临死亡需要宰杀的动物按照定期解剖的方法进行采血；
血样种类：
(1)血常规检测用(EDTA抗凝)；
(2)血清生化测定用血(不抗凝)；
7.5血常规检查
用7.4项下的(1)项的血液进行以下血常规检查项目。
7.6血清生化
用7.4项下的(2)血液制备的血清进行以下血液生化检查项目。
7.7剖检、组织病理学检查
7.7.1剖检
剖检例数：全部预定解剖的动物。
剖检方法：灌胃2％的戊巴比妥钠生理盐水溶液进行麻醉，从心脏采血完毕后处死，然后进行解剖。
脏器称量和固定保存肉眼检查组织器官有无明显异常，并对各组动物的以下(1)脏器进行称量，并且计算相对脏器重量；对以下(2)脏器进行固定保存：
(1)称量重量的组织器官：
心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、脑、肾上腺、睾丸、卵巢
(2)固定、保存的组织器官：
脑、心脏、肺、肝脏、肾脏、脾脏、胃、小肠、大肠、睾丸、卵巢、肾上腺
7.7.2组织病理学检查
检查方法：固定后的组织经修块取材，逐级酒精脱水，石蜡包埋，轮转式切片机切片(厚约6μm)，经苏木素-伊红(HE)染色，光镜下进行检查。
HE染色步骤为：将病理切片置于65℃烘箱中5min,将切片置于二甲苯中两次进行脱蜡，酒精梯度脱去二甲苯。苏木素染色6min,清水冲洗2min后，梯度乙醇依次脱水，伊红染色2min,无水乙醇浸泡3min后再置于二甲苯中浸泡3min,中性树胶封片。
8数据的统计解析
8.1如果资料符合正态性(检验P>0.05)，则进行单因素方差分析检验(F检验)。如果方差分析检验结果显著(P≤0.05)，当方差齐性时，则用LSD-t或Dunett-t参数检验法进行多重比较检验。当方差不齐性，则进行Dunett-T3参数检验法进行多重比较检验；如果方差分析结果不显著(P>0.05)，则统计结束。
8.2如果资料不符合正态性(P≤0.05)，则进行Kruskal-wallis检验(H检验)。如果Kruskal-wallis检验结果显著(P≤0.05)，则进一步用Mann-WhitneyU非参数检验法进行多重比较检验；如果Kruskal-wallis检验结果不显著，则统计结束。
以上统计分析均用GraphpadPrism6.0进行。
9结果
9.1一般症状
各剂量组大鼠给药后一般行为、毛发、大、小便等与对溶媒对照组相比未见明显差异。
结果显示：胜培元连续灌胃大鼠30天，500、1500、4500mg/kg/d各剂量组对大鼠一般症状无明显影响。
9.2体重测定
与溶媒对照组相比，各剂量组大鼠给药后均无差异。
结果显示：胜培元连续灌胃大鼠30天，对大鼠体重无明显影响。
体重均值变化见图1和图2。
图1为胜培元灌胃雌性大鼠体重的变化；
图2为胜培元灌胃雄性大鼠体重的变化
9.3摄食量测定
结果显示：胜培元连续灌胃大鼠30天，对大鼠摄食量无明显影响
食量均值变化见图3、图4。
图3胜培元灌胃雌性大鼠食量的变化
图4胜培元灌胃雄性大鼠食量的变化
9.4血常规检测
结果显示：胜培元连续灌胃大鼠30天，对大鼠血常规无明显影响。
图5胜培元灌胃雌性大鼠血常规的变化
图6胜培元灌胃雄性大鼠血常规的变化
9.5血液生化检测
胜培元连续灌胃雌性大鼠30天，4500mg/kg组与溶媒对照组相比，总胆固醇水平显著降低(P<0.05)；
胜培元连续灌胃雌性大鼠30天，1500、500mg/kg组与溶媒对照组比，谷丙转氨酶，谷草转氨酶，及肌酐水平均显著降低(p<0.01)；
胜培元连续灌胃雄性大鼠30天，1500mg/kg组与溶媒对照组比，谷丙转氨酶显著降低(P<0.05)；
其余生化指标未见明显差异。
结果显示：胜培元连续灌胃大鼠30天，可能能够提高大鼠的肝肾功能，但是需要进一步的实验证明。
图7胜培元灌胃雌性大鼠血生化的变化
图8胜培元灌胃雄性大鼠血生化的变化
9.6病理学检查
9.6.1脏器系数
胜培元连续灌胃雌性大鼠30天，各个剂量组与溶媒对照组相比，不存在统计学差异；
胜培元连续灌胃雄性大鼠30天，各个剂量组与溶媒对照组相比，不存在统计学差异；
结果显示：胜培元连续灌胃大鼠30天，对大鼠主要脏器相对重量和绝对重量无明显影响。
图9胜培元灌胃雌性大鼠主要脏器的绝对重量的变化
图10胜培元灌胃雄性大鼠主要脏器的绝对重量的变化
图11胜培元灌胃雌性大鼠主要脏器的相对重量的变化
图12胜培元灌胃雄性大鼠主要脏器的相对重量的变化
9.6.2病理组织学检查
9.6.2.1肉眼观察结果
胜培元连续灌胃大鼠30天，500、1500、4500mg/kg对大鼠各个组织脏器无明显影响。
9.6.2.2组织病理学观察结果
胜培元连续灌胃大鼠30天，500、1500、4500mg/kg对大鼠各个组织脏器未见明显病理改变。
图13胜培元灌胃给药对SD大鼠30天毒性实验肝脏组织图片
图14胜培元灌胃给药对SD大鼠30天毒性实验睾丸组织图片
图15胜培元灌胃给药对SD大鼠30天毒性实验卵巢组织图片
图16胜培元灌胃给药对SD大鼠30天毒性实验肾上腺组织图片
图17胜培元灌胃给药对SD大鼠30天毒性实验肾脏组织图片
图18胜培元灌胃给药对SD大鼠30天毒性实验肺组织图片
图19胜培元灌胃给药对SD大鼠30天毒性实验小肠组织图片
图20胜培元灌胃给药对SD大鼠30天毒性实验大肠组织图片
图21胜培元灌胃给药对SD大鼠30天毒性实验脑组织图片
图22胜培元灌胃给药对SD大鼠30天毒性实验脾组织图片
图23胜培元灌胃给药对SD大鼠30天毒性实验心脏组织图片
10结论
胜培元500、1500、4500mg/kg连续灌胃大鼠30天，安全剂量为大于或等于4500mg/kg，未发现毒性靶器官。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。