1、在培养物中加入某种底物与指示剂，经接种、培养后，观察培养基的PH值变化。
2、在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。
3、根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。
4、根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。
生化试验的注意事项
1、待检菌应是新鲜培养物。培养18-24h。
2、待检菌应是纯种培养物。
4、应做必要的对照试验。
5、提高阳性检出率，至少挑取2-3个待检的疑似菌落分别进行试验。
生化试验分类
（一）糖类代谢试验
（二）氨基酸和蛋白质代谢试验
（三）有机酸盐和铵盐代谢试验
（四）酶类试验
1.糖(醇)发酵试验
常用的糖、醇
单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖、鼠李糖
双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖
三糖：棉子糖
多糖：菊糖、肝糖、淀粉
醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇
方法
(2)培养基：液体糖发酵管，半固体糖发酵管，固体糖发酵管，双糖(或三糖)高层斜面发酵管。
结果
(1)接种的细菌，如能分解培养基中的糖(醇)类而生成酸，由于培养基内加有指示剂，故可使培养基中的指示剂呈酸性反应，如产生气体，则可使半固体培养基内或液体培养基中倒置的小管出现气泡。如若不分解则无任何反应。
不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。
记录：
产酸不产气，阳性，以“+”表示
产酸产气，阳性，以“⊕”表示
不产酸产气，阴性，以“-”表示
(2)在半固体糖发酵管中，还可以观察细菌的动力，若为有鞭毛的细菌，则沿接种线向周围扩散生长。若为无鞭毛菌，则仅在接种线处生长。
(3)在双糖(或三糖)高层斜面发酵管中，由于葡萄糖含量仅为乳糖或蔗糖的1/10，如细菌只分解葡萄糖，则斜面上产生的酸少，且易被氧化并因产生氨以及细菌分解培养基中的蛋白质产生碱性物质而变弱碱性，故斜面变为粉红色，而底层变酸，指示剂变色。若细菌分解葡萄糖，同时也分解乳糖或蔗糖时，则产酸量较多，底层和斜面均呈酸性，指示剂亦变色。若在此培养基中加入硫酸亚铁或尿素，同时还可以观察细菌产生硫化氢及尿素分解情况。
注意事项
(1)各种糖发酵培养基，含糖的浓度一般为5～10g/L，有时为20g/L。
(2)有些糖类，可因121℃高压蒸汽灭菌时水解变质，特别是在碱性溶液中更易被破坏，故含糖的培养基常用115℃，15min灭菌。亦可先将糖类单独配制成100～200g/L的水溶液，经115℃15min灭菌后，然后再以无菌操作的方法加入已灭菌的培养基中。此外，还可将糖的溶液用滤菌器进行滤过除菌，再加入培养基中。
2.甲基红(MR)试验
因此该试验是检查细菌发酵葡萄糖产生并保持稳定的酸性终末产物和克服体系缓冲作用的能力，某些细菌比其他细菌能够产生更多的酸。
(1)培养基：葡萄糖蛋白胨水(MR/VP培养基)。
(2)试剂：甲基红指示剂。
(3)操作：待检菌18～24h纯培养物接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中；37℃培养2～3d，每2ml培养液加2滴甲基红指示剂，立即观察。
MR阳性：培养物有足够的酸，能使培养基表面甲基红试剂仍保持明显的红色(pH4.4)；
MR阴性：培养基表面呈黄色(pH6.0)；
延迟反应：橙色，应继续孵育到4天，并重复试验。
3.伏普试验(V-P试验)
某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V-P（+）反应。
方法(Barritt法)
(1)试剂：甲液为60g/Lα－萘酚酒精溶液；乙液为400g/LKOH溶液.
(2)操作：首先将被检菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，经37℃培养4d。再按每2ml培养液中加入甲液lml、乙液0.4ml，充分摇动试管，观察结果。
通过使用有机化合物邻位-硝基苯β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)证明有无β-半乳糖苷酶活性，可预测细菌发酵乳糖的能力。若有半乳糖苷酶阳性的细菌存在，无色的ONPG试剂被水解，释放出黄色化合物邻位-硝基苯酚(ONP)。阳性β-半乳糖苷酶试验就是基于对邻位-硝基苯酚的检测。
(1)培养基：10g/L乳糖肉汤琼脂。
(2)试剂：0.01mol/L磷酸盐缓冲液；邻硝基酚β-D-半乳糖苷(ONPG)液。
(3)操作：首先将被检菌接种到10g/L乳糖肉汤琼脂上，经37℃培养过夜，以无菌方法取一接种环菌置于0.25ml的生理盐水中做成菌悬液，然后加ONPG液0.25ml，置于37℃温箱或水浴箱中，分别在20min和3h后观察结果。
如有β-半乳糖苷酶，一般在20～30min即呈现黄色者为阳性；如无此酶则24h不变色。
5.七叶苷水解试验
(1)培养基：七叶苷培养基。
(2)操作：以无菌方法将试验菌接种到七叶苷琼脂斜面培养基上，经37℃18～24h培养，观察结果。
6.石蕊牛乳试验
有的细菌如产气荚膜梭菌，对牛乳具有强烈发酵反应，产酸、产气、凝固、胨化几乎同时发生。所产生的气体，可将培养基表层的凡士林冲至管口，牛乳可全被胨化变清，这种被称为“汹涌发酵”是为该菌所特有。有的细菌不发酵乳糖，而分解含氮物质，生成氨及胺，使培养基变碱性，石蕊指示剂变蓝紫色。
(1)培养基：石蕊牛乳培养基。
(2)操作：首先将培养基表面的一层凡士林在酒精灯上熔化，然后无菌取被检菌接种到石蕊牛乳培养基中。接种后将培养基直立，置37℃温箱培养，观察结果。
产酸：若发酵糖产酸，使石蕊指示剂变为粉红色。产气：若发酵乳糖同时产气者，可冲开覆盖在培养基上的凡士林。凝固：若发酵乳糖产酸甚多，可使酪蛋白凝固。胨化：若将凝固的酪蛋白，继续水解成蛋白胨，此时牛乳培养基的上段则变清。产碱：若不发酵乳糖，分解含氮物质，生成氨及胺，使培养基变碱性，石蕊指示剂变蓝紫色。
1.靛基质（Imdole）试验
某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。
(1)培养基：蛋白胨水。
(2)试剂：Kovac试剂；欧氏试剂。
(3)操作：纯培养物接种蛋白胨水培养基35℃培养24～48h，沿管壁徐徐加入Kovac氏试剂或欧氏试剂0.5ml，分为两层，观察。
两层液体交界处出现红色为阳性，无色为阴性。
2.硫化氢试验
方法与结果
(1)琼脂穿刺法：
培养基：三糖铁培养基、含硫酸亚铁(或醋酸铅)的半固体培养基。
操作：将试验细菌以接种针沿管壁穿刺接种到含醋酸铅或硫酸亚铁培养基中，经37℃24h培养后，观察结果。
结果：培养基变黑色为阳性。当产生硫化氢量少时，为了便于观察结果，在穿刺接种培养时，一定要沿培养基管壁进行。
(2)醋酸铅试纸法：
培养基：含胱氨酸的半固体培养基、浸有醋酸铅的滤纸条。
操作：待检菌穿刺接种培养基，悬挂醋酸铅纸条，37℃培养24～48h。
结果：试纸呈黑色为阳性。该法较敏感。
(1)培养基：尿素琼脂。
(2)操作：将待检菌接种于尿素培养基，37℃培养18～24h，观察结果，如为阴性应继续观察4d。
4.明胶液化试验
(1)培养基：明胶培养基
注意事项:
5.苯丙氨酸脱氨酶试验
(1)培养基：苯丙氨酸培养基。
(2)试剂：100g/LFeCl3溶液。
(3)操作：被检菌浓厚接种于苯丙氨酸琼脂斜面上，37℃培养18～24h，滴加100g/LFeCl3试剂数滴于斜面上，自上流下观察。
6.精氨酸、鸟氨酸、精氨酸试验
(1)赖氨酸：赖氨酸经过赖氨酸脱羧酶作用生成尸胺和CO2。
(2)鸟氨酸：鸟氨酸经鸟氨酸脱羧酶的脱羧作用，产生腐胺和CO2。
(3)精氨酸：L-精氨酸经精氨酸脱羧酶的作用，可产生精胺和CO2。
(1)培养基：氨基酸脱羧酶培养基。
阳性反应试验管颜色变化过程
紫色→黄色→紫色
原理：
7.精氨酸双水解试验
(1)培养基：含精氨酸的氨基酸脱羧酶试验培养基及对照培养基。
(2)操作：自斜面培养物接种，作肠杆菌科的鉴定时可覆盖灭菌的液状石蜡，作假单胞菌属的鉴定时则不能覆盖液状石蜡。于37℃培养。
8.肉渣消化试验
(1)培养基：疱肉培养基。
(2)操作：试验菌按常规法接种于疱肉培养基，用蜡笔于培养基的肉渣上缘画一横线作为标记。于37℃培养数日。
9.凝固血清消化试验
(1)培养基：吕氏血清培养基。
1.柠檬酸盐利用试验
(1)培养基：柠檬酸盐培养基。
(2)操作：被检菌接种于柠檬酸盐斜面培养基上，35℃培养l～4d，观察。
指示剂为：1%溴麝香草酚蓝(酒精溶液)或0.04%苯酚红10mL/1000mL水
用脱脂棉过滤，制成后为黄绿色。
斜面有菌苔生长，培养基斜面变为蓝色或深蓝色，为阳性，记+；
无菌苔生长，培养基斜面仍为绿色者，为阴性，记-
2.马尿酸钠水解试验
三氯化铁法
原理：B群链球菌具有马尿酸水解酶，可使马尿酸水解为苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸与三氯化铁试剂结合，形成苯甲酸铁沉淀.
培养基:马尿酸钠培养基。
试剂：三氯化铁溶液。
操作：待检菌接种马尿酸钠培养基，35℃培养48h，离心沉淀，取上清液0.8mL加入三氯化铁溶液0.2mL，立即混合均匀，经10～15min观察结果。
结果：出现稳定的沉淀物为阳性，轻摇后沉淀物溶解为阴性。
茚三酮法
原理：马尿酸被细菌分解后，形成苯甲酸及甘氨酸。甘氨酸在茚三酮的作用下，经氧化脱氨基反应，生成氨，CO2和相应的醛，而茚三酮则生成了还原型茚三酮。其中形成的氨和还原型茚三酮，与残留的茚三酮起反应，形成紫色化合物。
方法：
试剂：l％马尿酸钠水溶液；3.5g茚三酮溶于100mL的1：1的丙酮，丁酮混合溶液。
操作：0.4ml待检菌与等量的1％马尿酸钠水溶液混合后，35℃培养2h，加入0.2ml茚三酮试剂，振摇后观察。
结果：出现紫色为阳性。
3.丙二酸盐利用试验
溴麝香草酚蓝：溴麝香草酚蓝是一种酸碱指示剂，变色范围pH6.0(黄)～7.6(蓝)。普通水是中性，pH也就是7左右，差不多呈淡蓝，溶有二氧化碳后，由于会形成碳酸，碳酸是弱酸，因此pH不会降太多，变黄。当中过渡颜色是绿色。
(1)培养基：丙二酸钠培养基。
(2)操作：被检菌接种于丙二酸盐培养基，于35℃培养24～48h后观察结果。
结果：培养基由绿色变为蓝色为阳性，颜色无变化为阴性。
1.氧化酶试验(Kovacs试验)
(1)试剂：10g/L盐酸四甲基对苯二胺水溶液，或10g/L盐酸二甲基对苯二胺水溶液。
(2)操作：取滤纸片蘸取待测菌落少许，加试剂一滴，观察颜色变化。也可用滴管吸取试剂，直接将一滴滴在待测菌菌落上，观察颜色变化。
结果：阳性者立即呈现粉红色或红色，颜色逐渐变深至深紫色。
2.过氧化氢酶试验(触酶试验)
(1)试剂：新鲜配制的3％过氧化氢水溶液。
(2)操作：挑取1环固体培养基上的待测菌菌落，放于洁净玻片上或试管内，滴加3％过氧化氢数滴，观察结果。实验时必须用18～24h新鲜培养物。陈旧培养物可能使触酶失活，出现假阴性结果。此外，不宜挑取血琼脂上的菌落，因红细胞内含有触酶，会导致假阳性结果。
3.硝酸盐还原试验
(1)培养基：硝酸盐培养基。
(2)试剂：①甲液：对氨基苯磺酸0.8g，5mol/L醋酸100ml；②乙液：α-萘胺0.5g，
5mol/L醋酸100ml。
操作：待测菌株接种到硝酸盐培养基中，35℃18～24h培养后，加入0.1ml甲、乙液等量混合液于试管内，观察结果。
4.过氧化物酶试验
（1）原理:过氧化物酶的作用是将过氧化氢中的氧转移给可被氧化的物质。
（2）其反应如下：试验时，若以联苯胺(4,4-二氨基联苯)作为被氧化的物质，试验细菌如有过氧化物酶存在时，加入过氧化氢可使苯胺氧化成为蓝色的联苯胺蓝。
（3）方法
（4）结果
5.脱氢酶试验
（1）原理
如果用无色TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）作为受氢体，在有脱氢酶存在的情况下，TTC可以接受氢而成为红色的Formazan（甲臜zā)。后者不再被氧气所氧化，所以试验不必在密闭的条件下进行。
（2）方法
(3)结果
6.氧化三苯基四氮唑试验(TTC试验)
(1)原理
(2)方法
(i)试剂
(ii)操作：①以无菌吸管吸取清洁中段尿2ml置于无菌试管中。②加TTC试剂应用液0.5ml。③混匀后，置37℃,8h培养后观察结果。
出现红色者为阳性，淡红色者为弱阳性，不变色者为阴性。
7.脂酶试验
8.磷酸酶试验
如有酚酞释出，菌落即变为粉红色
9.DNA酶试验
10.血浆凝固酶试验
(i)玻片法：在玻片上分别滴加新鲜人或兔血浆及生理盐水各一滴，挑取待检菌的菌落，
分别与血浆和生理盐水混合，立即观察结果，如血浆中有明显颗粒出现，而生理盐水中无自凝现象为阳性。
(ii)试管法：小试管3支内各加入l︰4稀释的新鲜人或兔血浆0.5ml，①其中一支加待检菌18～24h肉汤培养物0.5ml，②另一支加阳性菌株18～24h肉汤培养物0.5ml，③再一支加肉汤培养基0.5ml为阴性对照，轻振混匀。3支试管放37℃水浴中3～4h，观察结果。