不育症(infertility)是指与同一个伴侣在无保护措施的情况下以适当频率性交一年或以上无法发生妊娠。目前中国的不育症患者已经超过4000万，占中国总适龄生育人口的12.5％。而不孕症患者中有大约一半的原因是来自男方。随着男性不育症患者数量的逐年增加，男性不育已经成为世界范围内临床医学的重大问题之一。
弱精症(asthenozoospermia，as)是男性不育的主要病因之一，约有17.5％的男性不育患者存在弱精症。弱精症指精子运动能力低于正常精子运动水平，通常定义为有运动能力的精子占比低于50％或有前向运动能力的精子占比低于25％。精子运动能力低下的主要原因有睾丸或附睾代谢异常、精子尾部结构缺陷、死精症等，但其在分子水平上的机理尚不明确。
因此，本领域技术人员致力于研究弱精症的分子标记，以便为弱精症的诊断和治疗提供依据。
技术实现要素：
在本发明的第一方面，提供了一种组蛋白h3调节剂的用途，用于制备药物或组合物，所述药物或组合物用于选自下组的一种或多种用途：
(1)促进精子细胞分化成精子；
(2)提高精子活力；
(3)预防或治疗弱精症；和
(4)预防或治疗不育症。
在另一优选例中，所述组蛋白h3调节剂为促进组蛋白h3硫巯基化水平的物质。
在另一优选例中，所述组蛋白h3调节剂选自：化合物、抗体、多肽、sh-rna、dsrna、mirna、反义寡核苷酸或其组合。
在另一优选例中，所述组蛋白h3调节剂包括含硫化合物，如无机硫化物或有机含硫化合物。
在另一优选例中，所述含硫化合物选自下组：h2s、多硫化物(h2sn，如h2s2、h2s3)gsh、gssh。
在另一优选例中，所述组蛋白h3调节剂具有促进组蛋白h3的c111位点硫巯基化的能力。
本发明的第二方面，提供了一种硫巯基化的组蛋白h3，其中，所述硫巯基化的组蛋白h3中硫巯基化位点为c111。
在另一优选例中，所述硫巯基化的组蛋白h3的氨基酸残基编号依据seqidno.:1所示的组蛋白h3。
本发明的第三方面，提供了一种药物筛选方法，所述方法包括步骤：检测本发明第二方面所述的硫巯基化的组蛋白h3的水平，进而判断待测物质是否能促进组蛋白h3的硫巯基化。
在另一优选例中，所述药物筛选方法用于筛选药物，所述药物用于：
在另一优选例中，所述方法包括步骤：
(a)设置具有待测物质的测试组，并且设置无待测物质的对照组；
(b)检测测试组中硫巯基化的组蛋白h3的水平l1并与对照组中的硫巯基化的组蛋白h3的水平l0进行比较，
其中当l1显著高于l0，则表示所述待测物质具有促进组蛋白h3的硫巯基化水平的能力。
本发明的第四方面，提供了本发明第二方面所述的硫巯基化的组蛋白h3的用途，用于测试药物或化合物，所述药物或化合物促进或抑制所述硫巯基化的组蛋白h3的形成。
在另一优选例中，如果待测试物质能够促进所述硫巯基化的组蛋白h3的形成，则该待测物质可用于：
(3)预防或治疗弱精症；或
在另一优选例中，如果待测试物质能够抑制所述硫巯基化的组蛋白h3的形成，则说明该待测物质具有潜在的生殖毒性。
在另一优选例中，所述硫巯基化的组蛋白h3作为对照品或参考品。
本发明的第五方面，提供了一种调节精子活力水平的方法，包括步骤：调节组蛋白h3的硫巯基化水平。
在另一优选例中，当需要提高精子活力水平时，则执行提高组蛋白h3的硫巯基化水平的步骤。
在另一优选例中，当需要降低精子活力水平时，则执行抑制组蛋白h3的硫巯基化水平的步骤。
在另一优选例中，所述方法为体外非治疗性的方法。
本发明的第六方面，提供了一种组蛋白h3的硫巯基化药剂，其中，所述药剂具有将组蛋白h3的c111硫巯基化的能力；或者所述药剂具有促进组蛋白h3的c111位点硫巯基化的能力。
在另一优选例中，所述药剂包括含硫化合物，如无机硫化物或有机含硫化合物。
在另一优选例中，所述含硫化合物选自下组：h2s、多硫化物(h2sn，如h2s2、h2s3)、gsh、gssh。
本发明的第七方面，提供了一种预防或治疗弱精症的组合物，所述组合物包括本发明第六方面所述的组蛋白h3的硫巯基化药剂。
在另一优选例中，所述组合物为药品、或保健品。
本发明的第八方面，提供了一种预防或治疗弱精症的方法，所述方法包括步骤：给需要的对象施用本发明第六方面所述的组蛋白h3的硫巯基化药剂。
本发明的第九方面，提供了一种判断精子质量的方法，所述方法包括步骤：检测样本中本发明第二方面所述的硫巯基化的组蛋白h3的水平，进而判断待测样本的精子质量。
在另一优选例中，所述方法为体外非诊断性方法。
在另一优选例中，所述方法中，当硫巯基化的组蛋白h3的水平约占总组蛋白h3的30％(优选地，40％)以上时，则判定该待测样本的精子为高活力精子。
在另一优选例中，所述方法中，当硫巯基化的组蛋白h3的水平约占总组蛋白h3的20％(优选地，10％)以下时，则判定该待测样本的精子为低活力精子。
可以通过本发明的上述方法对动物精子质量进行判断。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1.人、斑马鱼和小鼠精子蛋白质巯基化水平的检测
a：巯基化蛋白的westernblot检测；b：精子全蛋白的银染检测。
图2.不同活力精子样品的蛋白质硫巯基化水平检测。
图4.不同活力精子样品的h3硫巯基化水平检测。
图6.不同运动能力的精子中蛋白质硫巯基化水平的比较
左图：不同运动能力精子中蛋白硫巯基化水平的wb检测结果
右图：蛋白相对表达量的统计分析结果。
(数值为三次独立重复实验数据的平均值，误差棒代表标准误。*：p值<0.05；**：p值<0.025)。
图7.精子中h3发生硫巯基化的比例分析
a：实验设计示意图；b：精子硫巯基化h3与总h3水平之比的检测。
图8.h3硫巯基化修饰的验证
a：以biotin抗体进行ip并以h3抗体进行wb识别
b：反向验证，以h3抗体进行ip并以biotin抗体进行识别
图9.分离后不同发育阶段的小鼠雄性配子细胞的鉴定
a：精原细胞、精子细胞、体细胞real-timepcr检测结果
spg：精原细胞；spd：精子细胞；sc：支持细胞
(数据为四次独立重复实验结果的平均值，误差棒为标准误)
b：细胞铺展实验显示，sycp3在减数分裂i前期各阶段的精母细胞中的分布。
ls：细线期；zs：偶线期；pd：粗线期。
图10.不同发育阶段的小鼠精子中蛋白质硫巯基化水平的检测
a：精子全蛋白质及h3硫巯基化水平在精子发生过程中的变化，以a-tubulin作为内参；
b、c：h3硫巯基化水平在精子发生过程中的变化，以h3作为内参。
(上述实验经过两次独立重复，结果一致。)
图11.人组蛋白h3各亚型蛋白含有半胱氨酸残基的片段序列
(箭头标记处是cys97及cys111)
图12.组蛋白h3.1及h3.3半胱氨酸残基的位置与突变示意图
h3.1(wt)：含有野生型h3.1蛋白序列的融合蛋白；
h3.1(c97s)：含有c97一个突变位点的h3.1蛋白序列的融合蛋白；
h3.1(c111s)：含有c111一个突变位点的h3.1蛋白序列的融合蛋白；
h3.1(双突变)：含有c97和c111两个突变位点的h3.1蛋白序列的融合蛋白；
h3.3(wt)：含有野生型h3.3蛋白序列的融合蛋白；
h3.1(c111s)：含有c111一个突变位点的h3.3蛋白序列的融合蛋白。
图13.半胱氨酸突变对h3硫巯基化修饰的影响
wt：野生型h3融合蛋白；c97s：c97突变型h3融合蛋白；
c111s：c111突变型h3融合蛋白；dm：c97和c111双突变型h3融合蛋白。
图14.h3.1硫巯基化位点的突变对c18-4细胞生长的影响
a：感染效率检查，phase：白光；gfp：绿色荧光信号
b：表达h3.1-wt与h3.1-c111s的c18-4细胞生长速度的区别
(数值为三次独立重复实验结果的平均值，误差棒代表标准误，*：p值<0.05)
图15.gssh合成反应中各分子结构示意图。
图16.不同浓度还原型谷胱甘肽对精子蛋白质硫巯基化水平的影响
上图：h3蛋白和硫巯基化h3蛋白的wb检测；
下图：硫巯基化h3蛋白的相对表达水平(数值为两次独立重复实验结果的平均值)。
图17.氧化还原条件下h3硫巯基化水平的变化。
图18.gssh对精子硫巯基化水平的影响
a：精子裂解前后gssh的处理对组蛋白h3硫巯基化水平的影响
b：精子裂解后加入gssh、gsh与gssg对h3硫巯基化水平的影响
(上述实验共独立重复两次，结果相同)
图19.gstm3催化蛋白质硫巯基化原理示意图
图20.gssh及gstm3对精子蛋白质硫巯基化水平的影响
(上述实验共独立重复两次，结果相同)。
具体实施方式
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
具体地，本发明首先开展了弱精症精子的硫巯基化修饰蛋白组学研究，并在人类精子发现了244个硫巯基化蛋白质。与正常精子相比，在弱精症精子中有34个蛋白质的硫巯基化水平显著下降，其中包括组蛋白3(h3)，另有12个蛋白质的硫巯基化水平明显增高。
经本发明人鉴定，h3.1蛋白分子中第111位的半胱氨酸(c111)是硫巯基化位点。然后，本发明人将该位点突变成丝氨酸，分别构建了h3.1野生型与突变型的慢病毒表达载体，并感染小鼠c18-4精原干细胞株。结果发现，与过表达野生型h3.1蛋白的细胞相比，过表达c111突变型h3.1蛋白的细胞生长速度显著增加，表明硫巯基化修饰对h3.1的功能具有重要的调节作用。
此外，本发明人还发现，与gsh相比，被硫巯基化修饰的还原型谷胱甘肽(gssh)具有更强的上调精子蛋白质(包括h3)硫巯基化水平的能力；而且与只有gssh存在相比，在gssh与gstm3同时存在的条件下，h3的硫巯基化水平得到进一步上调，提示gstm3与gssh是h3硫巯基化的生理性共调节因子。
综合上述，本发明结果表明，精子中蛋白中h3蛋白的硫巯基化修饰参与调控了精子运动能力的建立与维持，而h3的硫巯基化修饰异常参与弱精症的病理过程。
在本发明的一个优选地实施方式中，组蛋白h3的不同亚型h3.1、h3.2、h3.3、h3.5、h3.1t的氨基酸序列分别如下：
h3.1:martkqtarkstggkaprkqlatkaarksapatggvkkphryrpgtvalreirryqkstellirklpfqrlvreiaqdfktdlrfqssavmalqeaceaylvglfedtnlcaihakrvtimpkdiqlarrirgera(seqidno.:1)
h3.2:martkqtarkstggkaprkqlatkaarksapatggvkkphryrpgtvalreirryqkstellirklpfqrlvreiaqdfktdlrfqssavmalqeaseaylvglfedtnlcaihakrvtimpkdiqlarrirgera(seqidno.:2)
h3.3:martkqtarkstggkaprkqlatkaarksapstggvkkphryrpgtvalreirryqkstellirklpfqrlvreiaqdfktdlrfqsaaigalqeaseaylvglfedtnlcaihakrvtimpkdiqlarrirgera(seqidno.:3)
h3.5:martkqtarkstggkaprkqlatkaarkstpstcgvk-phryrpgtvalreirryqkstellirklpfqrlvreiaqdfntdlrfqsavvgalqeaseaylvglledtnlcaihakrvtimpkdiqlarrirgera(seqidno.:4)
h3.1t:martkqtarkstggkaprkqlatkvarkstpatggvkkphryrpgtvalreirryqkstellirklpfqrlmreiaqdfntdlrfqsaavmalqeacesylvglledtnlcvihakrvtimpkdiqlarrirgera(seqidno.:5)
本发明中，术语“调节”包括治疗、预防或干扰。
术语“治疗”是指基于治愈、缓解、改善、减轻、影响治疗对象疾病、症状、疾病体质(predisposition)的目的而给予需要治疗的对象本发明的h3蛋白硫巯基化促进剂。
术语“治疗对象”是指鼠、人及其他哺乳动物。
术语“治疗有效量”是指能够在治疗对象体内达到治疗目的的h3蛋白硫巯基化促进剂的量。本领域的普通技术人员应理解，所述“治疗有效量”可随h3蛋白硫巯基化促进剂的给药途径、所用药物辅料以及与其他药物联合用药情况的不同而有所不同。
药物组合物和施用方法
本发明的药物组合物包含安全、有效量范围内的本发明h3蛋白硫巯基化促进剂(活性成分)及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全、有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有0.001-1000mg的活性成分/剂，较佳地0.05-300mg的活性成分/剂，更佳地，含有0.5-200mg的活性成分/剂。
本发明的活性成分及其药理上可接受的盐可制成各种制剂，其中包含安全、有效量范围内的本发明的活性成分或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全、有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。活性成分的安全、有效量根据治疗对象的年龄、病情、疗程等具体情况来确定。
施用本发明组合物时，可以口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、局部给药。
本发明组合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的活性成分适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，每次给药剂量通常为0.01～300mg，优选0.5～100mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点在于：
(1)首次揭示了精子中蛋白中h3蛋白的硫巯基化修饰参与调控了精子运动能力的建立与维持，高活力精子中h3硫巯基化水平显著高于低活力精子；
(2)首次鉴定出了h3蛋白分子中第111位的半胱氨酸(c111)是硫巯基化位点。
(3)首次公开了硫巯基化修饰的还原型谷胱甘肽(gssh)具有更强的上调精子蛋白质(包括h3)硫巯基化水平的能力。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国sambrook.j等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1人精子中硫巯基化蛋白质组的研究
1.1材料与方法
1.1.1实验材料
1.1.1.1实验动物
成年雄性c57bl/6小鼠(8周龄)购自上海斯莱克实验动物有限公司(scxk(沪)2017-0005)和上海西普尔-必凯实验动物有限公司(scxk(沪)2013-0016)，实验用ab+斑马鱼购自北京维通利华实验动物公司(scxk(京)2014-0001)。小鼠饲养于上海市计划生育科学研究所spf级实验动物房(实验动物使用许可证：syxk(沪)2013-0027)，饲养条件为温度24℃，相对湿度50％，每日光照14hr，自由饮食采水。斑马鱼饲养于上海市计划生育研究所鱼类实验动物房，饲养条件为恒温26℃，水质ph7-8，硬度6-8。所有动物操作均遵循上海市计划生育科学研究所实验动物伦理规定。
1.1.1.2人精子样本
人精子样本由上海计生所医院经医学伦理批准，研究对象知情同意后收集。精液样本由研究对象禁欲2-5天后，通过手淫方法采集。精液经液化后采用计算机辅助精子分析(computer-aidedspermanalysis,casa)分析系统测定精子浓度及活动力。
1.1.1.3主要仪器设备
(1)自动精子运动分析仪casa(hamiltonthorne)
(2)高速冷冻离心机(avantijxn-26，beckman)
(3)台式离心机(centrifuge5430，eppendorf)
(4)垂直式电泳槽(美国bio-rad)
(5)天平(上海精天电子仪器)
(6)分析天平(上海上天精密仪器，fa1004)
(7)ph计(orionresearch)
(8)转膜仪(美国biorad)
(9)化学发光仪(上海天能科技)
(10)紫外分光光度计(evolotion60，thermo)
(11)超声破碎仪(上海科导超声仪器有限公司)
(12)质谱仪(scientificorbitrapfusion，thermo)
1.1.1.4抗体
westernblot(wb)和免疫沉淀(ip)检测中所用的biotin抗体(ab19221)，以及wb使用的tubulin抗体(ab18251)，均购自abcam公司。
1.1.1.5主要试剂
蛋白质电泳分子量标准购自thermo公司；
bca蛋白含量检测试剂盒购自南京凯基生物；
mmts、biotin-hpdp等试剂购自sigma公司；
氯化钠、tris、甘氨酸等试剂均购自上海生工公司；
丙酮、乙腈等液体试剂购自fisherchemical公司；
proteina/gagrose购自abcam公司；
ecl显色液：high-sigeclwbsubstrate购自上海天能公司。
1.1.2实验方法
1.1.2.1人精子预处理
获取人精子后，转移入10ml无菌试管中，于37℃培养箱中静置40min后，使精子完全液化。将精子转移至1.5ml离心管中，室温8000rpm离心5min后去除上清。以1mltbs重悬后，再次离心去除上清进行洗涤。再重复洗涤一次后，空转一次，以10μl小枪头吸净液体。
1.1.2.2小鼠精子获取
取性成熟雄鼠(8周龄)，断颈处死后立刻摘取附睾，放置于无菌滤纸上。在滤纸上尽可能去除其周围的血液、组织液、脂肪等。以精细镊子夹住附睾狭长中段并以剪刀在附睾尾剪开一刀，挤出精子并涂抹在无菌培养皿内。全部精子涂抹完毕后，以400μlh-czb培养液重复洗涤，收集后转移至1.5ml离心管内。室温8000rpm离心5min后，去除上清，并以1ml培养液重悬，并再次离心取上清。再重复洗涤一遍后，空转一次，并用10μl小枪头把上清吸净。
1.1.2.3斑马鱼精子获取
取成熟雄性斑马鱼(5月龄)置于繁殖缸内，与成熟雌鱼隔开网板培养。隔日上午取雄鱼，按压后腹部，挤出精子病涂抹于无菌培养皿内。全部精子涂抹完毕后，以1mltbs培养液重复洗涤，收集后转移至1.5ml离心管内。室温8000rpm离心5min后，去除上清，并以1ml培养液重悬，并再次离心取上清。再重复洗涤一遍后，空转一次，并用10μl小枪头把上清吸净。
1.1.2.4精子裂解
将精子以hen缓冲液(250mmol/lhepes(ph7.0)，5mmol/ledta，0.1mmol/lneocuproine)重悬并洗涤一次后，加入2.5％sds及蛋白酶抑制剂的hen缓冲液充分重悬后，冰上静置裂解10min；在冰上使用超声裂解(10w，1s，间隔2s，重复5次)；4℃15000rpm离心10min后，将上清转移至新的1.5ml离心管中备用。
1.1.2.5富集硫巯基化蛋白质的biotin-switch方法
在已裂解好的精子蛋白溶液中加入mmts至25mmol/l，55℃水浴20min，期间不断振荡；之后加入2倍体积的丙酮并上下颠倒混匀，再于-20℃静置20min沉淀蛋白；4℃15000rpm离心10min后，去除上清；以1ml丙酮重悬后，再次4℃15000rpm离心10min，去除上清，再空离一次，用10μl小枪头吸净液体并开盖自然晾干，确保丙酮挥发干净；再加入400μlhen缓冲液，并加入终浓度为1％的sds和终浓度为4mmol/l的biotin-hpdp，充分重悬，37℃水浴2hr；4℃15000rpm离心10min后，将上清转移至新的1.5ml离心管中，并作为样品；取部分样品，加入一倍体积无还原剂的sds上样缓冲液(5％sds，250mmol/ltris-cl6.8，0.01％溴酚蓝)，充分混合后，37℃水浴5min，作为sds-page电泳样品。
1.1.2.6免疫沉淀(immunoprecipitation，ip)
取已用hen缓冲液清洗好的proteina/g加入目标蛋白溶液，至其终浓度为5％(v/v)。室温颠倒混合1hr后，4000rpm离心5min，将上清转移至新的1.5ml离心管中。将抗体加入预清洗的蛋白溶液中至终浓独为1μg/ml，充分混合后，室温颠倒混合1hr；再次加入proteina/g至蛋白溶液中至浓度为5％；4℃颠倒混匀过夜，之后4000rpm离心5min，轻轻去除上清，再如此操作以hen缓冲液动作轻柔地洗涤3次；最后空离一次，吸净液体，加入50μlsds上样缓冲液(5％sds，250mmol/ltris-cl6.8，2mmol/ldtt，0.01％溴酚蓝)，100℃金属浴5min，室温4000rpm离心5min，将上清转移至新的1.5ml离心管中。
1.1.2.7sds-page
固定好1.0mm的配胶玻璃板后，加入预先混合好的分离胶5ml(10％丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺，375mmol/ltris-cl(ph8.8)，0.2％sds，0.2％过硫酸铵，0.1％temed)。再加入1ml无水乙醇，封平液面。待胶凝固后，去除并吸干乙醇，晾干确保乙醇挥发完全后，再加入3ml预先混合好的浓缩胶3ml(6％丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺，250mmol/ltris-cl(ph6.8)，0.2％sds，0.2％过硫酸铵，0.1％temed)，并插入梳齿。待胶凝固后，装入电泳装置，由内向外灌入500ml电泳缓冲液(0.31％tris-base，1.88％glycine，0.1％sds)。拔除梳齿后向梳孔中加入已预处理好的上样样品及蛋白标准品。接上电源后恒压80v后电泳15min，然后在170v条件下电泳60min直至溴酚蓝接近胶版底部。关闭电源后取出胶版，撬开胶版后切去上层胶，将胶转移至容器中待用。
1.1.2.8westernblotting检测(wb)
配置转膜缓冲液(0.31％tris-base，1.5％glycine，20％甲醇)1l后，将已进行电泳的sds-page浸入少量转膜缓冲液中平衡15min。同时剪取适当大小的pvdf膜，并浸入少量甲醇中10s进行预处理。在转膜液中将sds-page放入海绵垫之上并赶出气泡，再将pvdf膜覆于sds-page上并赶出气泡，再覆以海绵垫并赶出气泡。将已做好的胶、膜、海绵夹心，放入装置中，并往装置中灌满转膜缓冲液。接通电源后，恒压200ma电泳90min。之后去除电源，取出胶、膜、海绵夹心后，剪取pvdf膜上需要的部分，正面向上放入容器中。以tbs洗涤1次后，加入封闭液(以tbst稀释的5％脱脂奶粉)室温摇晃2hr后，再以tbst洗涤5min后，加入浓度为0.1％一抗溶液，4℃摇晃过夜。再以tbst洗涤10min3次，然后换以二抗溶液(以tbst稀释的0.05％二抗，5％脱脂奶粉)室温摇晃90min，再以tbst洗涤3次，每次5min。之后将膜正面向上放入曝光仪中，在其上加入适量预先1：1混合的ecl显色液，进行曝光显色。
1.1.2.9银染
将已进行电泳的sds-page胶转移至培养皿中，用去离子水洗涤1min2次以去除sds后，加入10ml固定液(50％甲醇，6％冰醋酸，0.05％福尔马林)室温摇晃2hr。换以10ml洗涤液(30％乙醇)洗涤20min3次后，再换以10ml致敏液(10ml0.02％硫代硫酸钠)洗涤2min。换以去离子水洗涤5min3次，再换以10ml染色液(0.2％硝酸银，0.076％福尔马林)浸泡20min。以去离子水快速洗涤1min2次后，换以显色液10ml(6％无水碳酸钠，0.05％福尔马林，0.0005％硫代硫酸钠)显色1min后，再换一次显色液，显色直至条带清晰后，换以10ml终止液(50％甲醇，6％冰醋酸)浸泡5min。最后换以10ml保存液(0.1％冰醋酸)进行长期保存，并进行拍照。
1.1.2.10质谱检测
将特定位置sds-page条带以解剖刀仔细切下后放入1.5ml管。将胶条切碎，使用含50mm碳酸氢铵的50％乙腈将胶块脱色。利用100％乙腈孵育5min将胶块脱水，之后移去体系中液相，加入终浓度为10mm的dtt溶液，37℃孵育1hr。再次使用100％乙腈孵育脱水，移去液相后加入终浓度为55mm的碘代乙酰胺，室温避光孵育45min。之后使用终浓度为50mm的碳酸氢铵清洗，再次使用100％乙腈孵育脱水。最后使用含有10ng/μl胰蛋白酶(trypsin)的50mm碳酸氢铵重悬胶块，冰上孵育1hr。除去样品中多余的溶液后，将胶块在37℃酶解过夜。酶解后的肽段依次使用50％乙腈/5％甲酸和100％乙腈提取出胶块，肽段溶液冷冻旋干后备用。
肽段用流动相a溶解后，经easy-nlc1000超高效液相系统进行分离。流动相a为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液，流动相b为含0.1％甲酸和98％乙腈的水溶液。液相梯度设置：0-18min，7％-25％b相；18-24min，25％-38％b相；24-27min，38％-80％b相；27-30min，80％b相，流速维持在350nl/min。
1.1.2.11质谱数据库检索
二级质谱数据使用proteomediscoverer1.3进行检索。检索参数设置如下：数据库设置为swissprothuman(20203条序列)；酶切方式设置为trypsin/p；漏切位点设置为2；一级母离子质量误差容忍度设置为10ppm；二级碎片离子的质量误差容忍度设置为0.02da；肽段离子打分要求高于20，鉴定结果peptideconfidence设置为high。
1.2实验结果
1.2.1人、小鼠、斑马鱼精子蛋白质硫巯基化
本发明人对人、小鼠和斑马鱼的精子进行了硫巯基化检测。结果表明，三个物种精子的硫巯基化的蛋白条带(分子量与灰度)基本相同，所能检测到的显著差别很少。在人的精子中，本发明人观察到一个分子量约为15kda的蛋白条带，而该条带在小鼠和斑马鱼精子中则未检测到(图1)。该结果初步说明了蛋白质的硫巯基化修饰在人、小鼠和斑马鱼的精子中具有较高的保守性，并进一步提示蛋白质的硫巯基化修饰可能对于精子维持其基本生理功能具有重要作用。
1.2.2人精子硫巯基化蛋白质的质谱鉴定
本发明人通过基于biotin抗体的免疫沉淀技术富集了精子硫巯基化蛋白质，对这些样品中的蛋白质种类进行了lc-ms质谱鉴定，共检测到4133个肽段。通过数据库检索，初步鉴定出833个蛋白质。剔除非特异性结果后，本发明人最终获得了由244个蛋白质组成的人精子硫巯基化蛋白质谱。在本发明发现的精子硫巯基化蛋白质的质谱鉴定中，h3得分较高。
进一步实验发现，精子中h3的硫巯基化水平比精子细胞中高出18倍，提示h3硫巯基化修饰可能在精子形成阶段发挥重要的调控作用。
因此，本发明人进一步地对组蛋白h3硫巯基化修饰进行了研究。
实施例2蛋白质硫巯基化与精子运动能力的关系
本发明研究发现精子蛋白质硫巯基化修饰参与调控精子的运动能力，本实施例将主要围绕这一假设展开。
2.1实验材料
2.1.1实验材料与试剂
2.1.2抗体
wb检测所用的h3k4me3、h3k9me3和h3k27me3抗体均购自abcam公司。货号分别是ab8580、ab8898与ab4729。
2.2实验方法
2.2.1精子上游法分离具有不同运动能力的精子
精子上游法是一种简易的精子分选方法，能够从精液样品中分离运动能力较强的精子。尽管该方法尚存一定的不足之处，例如对精子造成物理性损伤并影响受孕率但并不会改变蛋白质水平，所以它目前仍然是临床中常规的精子分选法之一。具体操作：待精液液化后，以1ml输卵管液重悬后转移至10ml无菌试管中。在其上方缓缓加入1.2ml含5％人血清白蛋白(has)的输卵管液，期间尽量保持与下层液面分界线的完整。缓慢45度倾斜后，于37℃培养箱中静置1hr。把试管放直后，缓缓吸取上层液面1ml培养液，内含高运动能力精子。然后再吸取下层液面0.5ml培养液，其内的精子作为低运动能力精子样品。
2.2.2统计分析方法：
2.2.3蛋白质功能分类：
2.3实验结果
2.3.1精子活力与精子硫巯基化蛋白质整体强度的关系
为了了解精子蛋白质硫巯基化与精子运动的关系，本发明人收集了33份临床精液样本，并对精液量、精子密度、前向运动精子所占百分比(pr％)、精子存活率等指标进行了检测(表3.1)。然后，本发明人对每一份精子的硫巯基化蛋白质也进行了检测。图2中的结果是10例pr％值不同的精子硫巯基化蛋白质的电泳分析图。根据该结果，本发明人可以比较直观地观察到，精子蛋白质硫巯基化水平随着pr％值的下降而呈现逐渐降低趋势。
2.3.2弱精症精子硫巯基化蛋白质谱的建立
表3.1精液样本参数
2.3.4精子运动能力与h3硫巯基化水平的关系
2.4讨论：
最后，本发明人成功实现了对巯基化h3绝对量的检测，发现硫巯基化h3的量占h3总蛋白量的10-40％之间。
实施例3组蛋白h3硫巯基化修饰位点确定
3.1实验材料
3.1.1细胞系
小鼠睾丸间质细胞株tm-3,购自苏州北纳创联生物技术有限公司，货号为bncc100249。小鼠精原干细胞株c18-4由上海交通大学医学院何祖平教授实验室惠赠。细胞培养于含10％胎牛血清(fbs)的dmem/f12培养基，培养于37℃、含5％co2的恒温培养箱中。每2-3天更换新鲜培养液。鉴定用细胞培养于6孔板中，病毒感染细胞培养于6cm培养皿及96孔板中。
3.1.2h3.1野生型及其突变体表达质粒与病毒制备
本实验所使用的h3表达载体均委托上海市吉凯生物技术有限公司进行构建：分别克隆了h3.1(含野生型与2个突变型)的表达框与h3.3(含野生型与1个突变型)的表达框。此外在组蛋白n段还克隆了编码flag标签的序列。图11是上述表达框的结构示意图。表达载体pcdna3.1用于上述h3蛋白表达载体的构建。
本发明人还委托上海市吉凯生物技术有限公司构建了能分别表达野生型与突变型h3.1的重组慢病毒各一株。慢病毒中h3.1的表达框与上述h3表达载体中的h3.1表达框是相同的。此外，这些重组慢病毒还克隆有独立的gfp蛋白表达框。
3.1.3抗体
wb和ip所使用的h3抗体(ah433)、ip所使用flag抗体(af519)，以及wb所用的hrp山羊抗兔二抗(a0208)均购自碧云天公司。免疫组化实验所使用h3k4me3(ab8580)、h3k9me3(ab8898)、h3k27me3(ab4729)、sycp3(ab15093)抗体均购自abcam公司。
3.2主要仪器设备
(1)倒置显微镜(olupusbh-2)；
(2)正置荧光显微镜(nikon50i)；
(3)超净工作台(上海新苗医疗器械制造有限公司)；
(4)细胞恒温co2培养箱(hepaclass100，thermofisherscientific)；
(5)血球计数板(德国marieenfeld公司)；
(6)一次性细胞培养皿，6孔板，96孔板(thermofisherscientific)；
(7)切片机(leica，rm2236)；
(8)防脱片载玻片(江苏世泰科技有限公司)。
(9)激光共聚焦显微镜a1+(nikon)
(10)微量核酸浓度测定仪nanodrop(thermo)
(11)lightcycler480ii荧光定量pcr仪(roche)
3.3主要试剂
透明质酸酶和胰蛋白酶(sigma公司)；
细胞转染试剂(x-tremegene9dnatransfectionreagent，罗氏制药)；
细胞培养液(dmem/f12(thermofisherscientific)；
胎牛血清(gibco)；
rna抽提使用mirneasyminikit试剂盒(qiagen)；
real-timepcr使用faststartuniversalsybrgreenmaster(roche)。
3.4实验方法
3.4.1小鼠精原细胞分离、精母细胞与精子细胞分离
本发明人了使用改良的sta-put法分离精原细胞。取7～8日龄雄性小鼠5只，处死后立刻无菌收集两侧睾丸，并置于盛有pbs的培养皿中。仔细去除脂肪垫、附睾及睾丸白膜后，加入适量1.0mlpbs吹打以吹散曲细精管。组织体积10倍的含1.0g/l胶原酶的pbs后，在37℃、5％co2环境下孵育15min(期间晃动数次)。之后移入5ml的离心管，轻轻吹打2次后静置5min。待曲细精管段沉降后轻轻吸除上清，再重复1次。加入含1.5g/l透明质酸酶和0.25％胰蛋白酶的pbs后在同样条件下孵育10min。依次经过80μm和40μm孔径尼龙网过滤。加入10％nbs(用dmem稀释)终止消化，移入离心管中，1000rpm离心3min，去上清。用dmem/f12培养液清洗2次后，将细胞移入1500ml含有2％-4％梯度牛血清白蛋白的dmem/f12培养液中，在4℃进行沉降2hr。弃去前50ml流出液，然后以90s间隔，连续分段收集至15ml培养管内，每管15ml。合并前3-13管细胞，进行细胞培养。每12hr观察贴壁情况。当见到混杂其中的睾丸体细胞开始贴壁时，取出培养皿并慢慢倾斜，将培养液连同尚未贴壁的精原细胞吸出，1000rpm离心3min，去上清即为精原细胞。
取性成熟雄鼠(8周龄)2只，处死后立刻无菌收集两侧睾丸组织，采用上述的sta-put分离方法进行处理，合并前3-13管细胞作为精母细胞，20-30管细胞作为精子细胞。
3.4.2小鼠精原细胞与精子细胞的分离和鉴定
本发明人需要对上述分离的处在精子发生不同阶段阶段的细胞的性质与纯度进一步鉴定。具体如下：对精原细胞与精子细胞(包括圆形和长形精子细胞)以及支持细胞的区分采用的是real-timepcr法检测各期标志物基因的表达水平。精原细胞标志物基因是泛素羧基末端水解酶l1(ubiquitinc-terminalhydrolasel1，uchl1)。精子细胞的标志物基因是顶体囊泡蛋白1(acrosomalvesicleprotein1,acrv1)。支持细胞的标志物基因是生殖同源框5(reproductivehomeobox5,rhox5)。引物序列如下：
uchl1-f:5’-agatgctgaacaaagtgttg-3’(seqidno.:6)；
uchl1-r:5’-acccgacactggccctcctg-3’(seqidno.:7)；
acrv1-f:5’-agcttcggttcagcaactttca-3’(seqidno.:8)；
acrv1-r:5’-gttatggctgcagatgtgct-3’(seqidno.:9)；
rhox5-f:5’-gctgagggcactgagagc-3’(seqidno.:10)；
rhox5-r:5’-tcaaatcaaaatctcggtgt-3’(seqidno.:11)
此外，对于减数分裂i前期的精母细胞的鉴定，则使用更直观的方法，即在细胞铺展实验中检测联会复合体蛋白3(synaptonemalcomplexprotein3,sycp3)的表达，该方法还能用于鉴定处于减数分裂i前期各阶段的精母细胞，具体操作如下：取经sta-put法分离得到的小鼠精母细胞在低渗液(20mmol/ltris-cl，50mmol/l蔗糖，17mmol/l柠檬酸，5mmol/ledta，2.5mmol/ldtt，1mmolpmsf,ph8.2)中浸泡40min之后，加入终浓度为100mmol/l的蔗糖终止反应。将细胞悬液滴于玻片上，并用1％pfa铺均匀。将细胞铺片于室温(20℃)自然风干后，进行免疫荧光实验。
3.4.3实时荧光定量pcr(real-timepcr)
将分选完成的细胞放入qiazollysisreagent中，使用匀浆器匀浆后，按照mirneasyminikit试剂盒抽提总rna，并使用nanodrop测定所抽提rna的浓度及质量。取1μg总rna按说明书的方法，使用fastquantrtkit试剂盒进行反转录。得到cdna以去离子水稀释20倍后作为模板，使用faststartuniversalsybrgreenmaster试剂盒进行荧光定量pcr，使用rochelightcycler490ii荧光定量pcr仪进行实验，结果分析使用随机软件。
3.4.4质粒感染
将c18-4细胞接种至6孔板中，生长过夜至70-90％的覆盖度。将100μl无血清培养基加入6μl转染试剂x-tremegene9，轻柔吹打混匀。再加入2μg的表达载体dna，混匀后于室温孵育30min。然后将转染复合物逐滴加入至细胞中，孵育48hr。
3.4.5蛋白质功能分类
3.5实验结果
3.5.1人精子中h3蛋白硫巯基化验证
在建立额人精子硫巯基化蛋白质组中，组蛋白h3的得分很高，其质谱强度、覆盖率等也都很高。为了进一步证实，组蛋白h3是否确实发生了硫巯基化，本发明人先对精子蛋白进行biotin-switch处理，并通过以biotin抗体介导的ip技术富集了精子中硫巯基化蛋白质，然后再通过常规的wb技术检测免疫沉淀中是否确实存在h3。结果表明，h3存在于基于biotin抗体的免疫沉淀中(图8中的a)。同时，本发明人还用h3抗体对经过biotin-switch处理的精子蛋白进行ip实验，以富集h3。然后用biotin抗体通过常规wb技术检测这些被富集的h3中是否存硫巯基化h3。结果表明，ip中确实存在硫巯基化h3。此外在未进行biotin-switch处理的样品无法检测到硫巯基化信号(图8中的b)。综合上述结果，表明精子中h3蛋白确实发生了硫巯基化修饰。
3.5.2小鼠精子发生过程中h3硫巯基化水平的变化
之后，本发明人检测了这四种细胞中硫巯基化蛋白水平的变化。结果显示，在精原细胞中检测到几个条带，其水平都比较低；在减数分裂粗线期精母细胞中，本发明人发现一个分子量介于55-70kd的蛋白质的水平明显增加，提示某些蛋白质的硫巯基化修饰参与了减数分裂进程(图10中的a)。在减数分裂完成后，配子细胞分化成单倍体的精子细胞细胞。蛋白质硫巯基化在精子细胞细胞发生很大变化。这主要体现在下述两方面，其一是两条高分量的条带的水平明显增加。其二是几个分子量在15-25kd之间的蛋白质其水平显著增加。后一变化在成熟精子中还有进一步加强。而两条高分子量的条带则消失(图10中的a)。上述结果表明，在精子发生过程中蛋白质硫巯基化修饰水平处于动态变化中。
本发明人还检测了这四种细胞中h3硫巯基化水平的变化，结果发现在此精子发生的四个阶段，组蛋白h3硫巯基化水平逐渐增加。在精子形成阶段，组蛋白大量被清除，最后仅有约5-15％的组蛋白还保留在精子中。因此，本发明人用组蛋白h3作为内参再次研究了这四个阶段组蛋白h3硫巯基化水平的变化。结果表明，从精子细胞分化成精子的过程中，组蛋白h3的相对硫巯基化水平增加约为18倍(图10中的b和c)。
3.6组蛋白h3.1及h3.3硫巯基化位点的鉴定
为了深入研究组蛋白h3硫巯基化的功能，本发明人鉴定了h3硫巯基化的氨基酸位点。理论上蛋白质硫巯基化修饰发生在蛋白质半胱氨酸残基(cys)上。人h3蛋白共有5个亚型，即h3.1、h3.2、h3.3、h3.5、h3.1t，其中h3.1和h3.1t分别在97位和111位有两个半胱氨酸。其它亚型仅在111位存在半胱氨酸，而在97位为丝氨酸(图11)。本发明人重点对h3.1与h3.3中的硫巯基化进行了分析。为此，本发明人别构建了h3.1与h3.3与flag的融合蛋白表达载体，控制这些基因表达的是cmv启动子，并分别将c111或/和c99的密码子突变为丝氨酸(ser)的密码子(图12)。选择丝氨酸是考虑到尽量减少氨基酸突变对蛋白质除硫巯基化修饰之外的影响，丝氨酸在亲水性、带电荷性、空间位阻等方面都和半胱氨酸接近，影响相对最小。有许多研究也采用同样方法以丝氨酸替代半胱氨酸，且不会改变蛋白质酶活性及其它特性，还有的研究将蛋白质中所有半胱氨酸(9个)全部替换为丝氨酸。该突变型仍能够保持部分活性，可见这一替换具有可靠性。
通过瞬时转染技术，本发明人将flag-h3.1及其突变型的表达载体分别转入小鼠睾丸间质细胞系tm3细胞，观察突变对flag-h3.1硫巯基化的影响。在确认细胞能表达外源质粒后，本发明人对胞内蛋白进行biotin-switch处理，并以flag抗体进行免疫沉淀，再以biotin抗体通过普通wb检测其硫巯基化信号。结果表明：c111s的突变导致flag-h3.1蛋白检测不到硫巯基化信号，而c99s突变对flag-h3.1硫巯基化水平无影响，提示h3.1的硫巯基化发生在c111上。通过相同的实验，本发明人证实h3.3的硫巯基化也发生在c111上(图13)。
3.7h3硫巯基化功能的研究
h3硫巯基化修饰是否对h3的功能产生影响，这无疑是一个关键问题。为了研究该问题，本发明人初步观察了c111s的突变对h3.1功能的影响。首先本发明人构建了flag-h3.1-wt、flag-h3.1-c111s的慢病毒表达载体。然后将两株慢病毒分别感染小鼠精原干细胞株c18-4。在阴性对照组中本发明人感染的慢病毒株与上述的慢病毒基本相同，只是不包含上述h3表达框。根据慢病毒表达载体自身所带的荧光蛋白gfp的情况分析，本发明人发现c18-4细胞的感染率可长期稳定在95％以上，且不受c111s突变的影响(图14中的a)。此外，本发明人发现感染flag-h3.1-wt病毒的细胞其生长速度与阴性对照组相比，细胞生长速度无明显区别，表明外源h3.1的表达没有对细胞生长带来明显影响。但是本发明人发现，c111s突变能明显增加c18-4细胞的生长速度(图14中的b)，表明h3.1的硫巯基化对细胞生长具有抑制作用。
为了探讨h3硫巯基化修饰发挥其生物学效应的潜在分子基础，本发明人用pymol软件对文献已报道的h3在核小体中的结构进行了分析，结果发现：h3在核小体中以二聚体的形式存在，两个h3蛋白羧基末(c端)的α-helix彼此靠近，其中111位半胱氨酸残基彼此之间的距离为6.36a，理论上它们之间难以形成化学键。但这个距离刚好可以容纳两个硫原子，由此本发明人推测，当两个h3的这一位点都发生硫巯基化后，两个巯基上的硫原子距离将会非常接近，很可能会形成氢键从而增加二聚体间的作用力，并增加核小体的稳定性。
3.8讨论：
在本发明中，本发明人发现了一种新的h3翻译后修饰，即在人与小鼠的精子中h3被硫巯基化修饰。本发明人还证实h3.1与h3.3发生硫巯基化的位点位于c末端的第111位的半胱氨酸残基(c111)上。c111在h3.2与h3的其它变体中高度保守，因此，h3.2与h3的其它变体也会被硫巯基化修饰。本发明人的上述研究结果拓宽了人们对基于h3翻译后修饰的表观遗传学调控认识，对于研究精子发生的表观遗传学调控网络、精子质量异常的表观遗传学基础都具有重要意义。
本发明人还发现h3硫巯基化在精原细胞、初级精母细胞中维持一个较低的表达水平；然后在精子细胞细胞中开始增加，在成熟精子中的硫巯基化水平则发生巨大增加。而h3几个研究较多的甲基化修饰却并不存在这一现象。这无疑是一个令人印象深刻的变化，证明h3的硫巯基化可能参与了精子形成过程。
与h3和h4蛋白在修饰后被清除相反，本发明人发现小鼠精子中h3的硫巯基化水平远远高于精子细胞细胞。该结果提示，包含有硫巯基化h3的核小体将在组蛋白被系统性清除阶段被保留下来。本发明人的蛋白分子结构分析结果表明，如果核小体中两个h3都发生硫巯基化，则它们之间可能建立氢键联系。这将加强核小体的结构稳定性，有利于防止了组蛋白被清除。
实施例4氧化还原平衡对人精子蛋白质硫巯基化的影响
尽管已有不少蛋白质被发现能够被硫巯基化修饰，但巯基供体目前尚不明确。例如，能促进蛋白质硫巯基化的硫化氢不是蛋白质硫巯基化反应的巯基供体。另外，体外生化研究表明，过硫化物能够与蛋白质中半胱氨酸的巯基发生反应，并生成硫巯基化。不过该类反应是否在细胞内也同样发生，目前尚无报道。细胞内发现的过硫化物包括半胱氨酸衍生物cys-sh(硫巯基化半胱氨酸)与gssh(被硫巯基化的gsh)。
gssh是最近才被发现的细胞内过硫化物，虽然gssh仅比gsh多一个巯基(图15)，但它具有比gsh及硫化氢更强的还原性。gssh生物合成依赖cystathionine-β-synthase(cbs)、cystathionineγ-lyase(cse)或glutathionereductase(gsr)等酶的催化，也是硫化氢信号通路的产物之一。gssh在细胞内易分解并间接产生硫化氢，并能够直接中和ros等氧自由基以保护细胞免受氧化损伤。
4.2材料与方法
4.2.1gssh合成
参考文献进行gssh的合成(artaudi,galardone.chembiochem.2014；15(16):2361–2364)。
4.2.2小分子lc-ms质谱检测
4.3实验结果
4.3.1gsh处理对精子蛋白质硫巯基化水平的影响
作为gstm3的底物之一，gsh也是重要的内源性抗氧化物，因此，本发明人检测了gsh对精子蛋白质硫巯基化的作用，以了解还原剂对精子蛋白质硫巯基化的影响。本发明人将正常精子培养于含不同浓度gsh的培养液中1hr后，检测其蛋白质硫巯基化水平的变化，结果显示，随着gsh的浓度升高，高分子量的部分蛋白硫巯基化水平也逐渐增加，但低分子量蛋白的变化并不明显(图16)。本发明人还发现，gsh处理对精子中h3蛋白的硫巯基化水平有明显影响。在gsh浓度不高于1μmol/l条件下，gsh能上调h3硫巯基化水平，但未观察到明显的剂量效应。在gsh浓度上升至2μmol/l以上，h3硫巯基化水平反而发生大幅下降(图16)。上述结果提示，细胞氧化还原平衡状态对精子蛋白质硫巯基化修饰水平具有调节作用。
4.3.2过氧化氢处理对精子蛋白质硫巯基化水平的影响
图17显示了氧化还原条件下h3硫巯基化水平的变化。研究广泛发现双氧水(h2o2)处理细胞能导致细胞内发生异常的氧化反应，而硫化氢则具有抗氧化能力。为了研究氧化还原条件下h3硫巯基化水平的变化，我们将不同浓度(微摩尔)的h2o2与nahs(细胞培养实验中常用作硫化氢的替代品)分别处理人的精子。用westernblotting技术分析h3硫巯基化水平，并以h3作为检测时的loadingcontrol。结果表明，h2o2与nahs能分别明显地降低与增加h3硫巯基化水平。该实验表明h3硫巯基化水平是一个灵敏的、反映细胞内氧化-还原状态的感性器(biosensor)。
4.2.3gssh的合成与鉴定
为了了解gssh是否能影响精子蛋白质硫巯基化，本发明人自己在实验室对gssh进行了化学合成制备。为了检测所制备gssh的纯度，本发明人对其进行了lc-ms检测，结果显示，质谱图中存在一个大小为340kda的显著洗脱峰，即为gssh。
4.3.4gssh对精子h3硫巯基化水平的影响
在获得了含gssh的合成产物后，本发明人首先观察了该产物对精子蛋白质硫巯基化水平的影响。本发明人分别在精子裂解前、后加入了终浓度为1mmol/l的gssh混合物，结果显示，gssh有提升精子h3硫巯基化水平的趋势，且该趋势在精子裂解后加入gssh时更为显著(图18中的a)，提示其对硫巯基化的作用方式较为直接。
本发明人观察比较了gssh、gsh与gssg对精子h3硫巯基化影响的强弱。为此，本发明人在精子裂解后分别加入相同浓度(1mmol/l)的gssh产物、gsh和gssg，并检测了h3硫巯基化水平的变化。结果显示，gssh产物则上调h3硫巯基化水平的趋势相对gsh与gssg更为明显(图18中的b)，这提示gssh能促进h3蛋白的硫巯基化。
4.3.5gstm3与gssh对精子蛋白质硫巯基化水平的协同作用
由于gsh是gstm3的反应底物之一，而gssh是只比gsh多一个巯基的gsh衍生物，因此，本发明人提以下假设：gstm3有可能将gssh转移至蛋白质半胱氨酸位点，而由于蛋白质与gssh连接的三硫键及不稳定，容易发生断裂，从而最终使蛋白质发生硫巯基化(图19)。为此，本发明人以gstm3抗体对精子中的gstm3蛋白进行免疫沉淀富集并纯化后，检测了gstm3和gssh，以及它们共同作用下对裂解后精子蛋白的影响。结果显示：gssh与gstm3同时存在时，h3硫巯基化水平发生显著提升，并高于gssh单独处理后的h3硫巯基化水平(图20)，提示gssh很可能是胞内蛋白质硫巯基化的巯基供体，而gstm3蛋白可能参与并催化这一过程。
4.4讨论：
本发明人发现gssh具有比gsh显著更强的促进h3与其它精子蛋白硫巯基化的作用。本发明人这一实验结果表明，gssh能通过提高蛋白质硫巯基化水平而调节细胞内氧化还原的平衡。而gssh的这一功能在本发明之前尚未见于报道。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。