国际大型EQA项目揭秘PIK3CA基因检测在乳腺癌治疗中的关键角色。
近期，TheJournalofMolecularDiagnostics杂志发表的一项研究分析了HR+/HER2-IBC组织样本中PIK3CA突变检测的质量保证（QA）情况[5]。研究者通过采用国际外部质量评估（EQA）项目，评估了不同实验室的检测性能和检测结果的可重复性。
图1研究标题截图
研究设计
本研究由德国QuIP机构组织，自2021年起，首次开展了针对PIK3CA突变检测的国际性EQA项目。参与实验室需对提供的HR+/HER2-乳腺癌组织样本进行PIK3CA突变分析并报告结果。2022年PIK3CA乳腺癌组织（MolPath）能力测试同样由德国QuIP机构组织，但仅在欧洲国家/地区开展，其采用与2021年相同的牵头研究所（LPI）以及相同研究设计。
EQA计划包括三个阶段。第一阶段包括样本收集、由LPI进行内部样本测试以及为内部质量评估（IQA）准备载玻片；第二阶段进行IQA，此外还包括EQA的准备工作，最终选择10例样本接受EQA，EQA队列包含5例总体至少携带三种不同PIK3CA突变的IBC样本和5例PIK3CA野生型IBC样本。第三阶段，EQA测试集包含至少10例样本，这些样本需由研究者分析并报告。
图2研究设计流程图
研究关键结果
01
2021年阶段1：IQA内部测试及样本选择
在21例HR+/HER2-IBC样本中，有5例显示肿瘤内异质性[即至少2个福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织块的PIK3CA检测结果不一致，例如1个组织块携带PIK3CA热点突变，而另1个组织块检测结果为野生型，或者2个组织块携带不同突变]。1例样本因肿瘤细胞含量不足被排除在IQA之外。最终IQA队列包括15例样本，每例有2个合适的FFPE肿瘤组织块。
表1牵头实验室和两个专家组实验室使用的IQA方法
02
2021年阶段2：IQA结果和EQA样本选择
IQA队列中的每个组织块都由LPI和两个专家组实验室之一进行测试，以确定PIK3CA突变状态的参考值。由于结果不一致，样本8、9和15被排除在EQA队列之外。最终，共10例样本通过了EQA的纳入标准，其中5例为PIK3CA野生型，5例为PIK3CA热点突变。
03
2021年阶段3：EQA结果
共有63个实验室注册参加了此次EQA，其中13个来自德国、奥地利和瑞士（EQA部分1），50个来自其他18个国家（EQA部分2）。
在EQA部分1中，13个中心中有11个通过了EQA（成功率84.6%）。大多数参与者使用自动化DNA提取方法（76.9%）。46.2%的参与者使用下一代测序（NGS）进行PIK3CA突变状态评估，成功率为100%；23.1%使用Sanger测序，成功率为66.7%。
EQA部分2中，50个国际实验室中有44个提交了结果（提交率88.0%），其中39个通过了EQA（成功率88.6%）。大多数参与者手动提取肿瘤DNA（79.5%）。突变/等位基因特异性荧光定量PCR（qPCR）是最常用的方法（62.8%），其次是NGS（30.2%），成功率分别为92.6%和84.6%。
04
2022年PIK3CA熟练度测试
2022年IQA成功完成测试后，最终熟练度测试集包括10例IBC样本，其中6例为PIK3CA热点突变，4例为PIK3CA野生型。33个EQA注册参与者中有33个在收到测试样本集后10个工作日内报告了结果，成功率为87.9%。不同的分子检测方法被使用，其中NGS是最常用的方法，其次是突变/等位基因特异性qPCR。
图32022年EQA：用于确定PIK3CA突变状态和相应成功率的方法
研究结论解读
PIK3CA突变检测EQA是评估和提高实验室检测能力的有效手段。研究结果强调了实验室IQA和参与EQA的重要性，以确保患者能够接受到基于准确基因检测的个体化治疗。
EQA计划的实施与成功率
在EQA部分1中，84.6%的参与者成功完成了测试。相比之下，2020年原型EQA的通过率为80%。在国际EQA部分2中，88.6%的参与者通过了测试，2022年欧洲范围内的EQA成功率为87.9%。总体而言，国际实验室的参与度高，成功率也较高，显示了全球对PIK3CA突变检测的重视和能力。
检测方法的多样性与局限性
在EQA计划中使用了多种检测方法，其中NGS和突变/等位基因特异性qPCR是最常用的检测PIK3CA突变的方法，成功率较高。德语区更倾向于使用NGS，而国际参与者主要使用突变/等位基因特异性qPCR方法。2021年，使用突变/等位基因特异性qPCR方法的实验室成功率为92.6%，而使用NGS方法的成功率为84.6%。然而，2022年NGS方法的成功率（96.0%）高于突变/等位基因特异性qPCR方法（60.0%）。
尽管检测成功率整体较高，但特定检测工具仍存在局限性。例如，CobasPIK3CA突变测试因为设计上的限制而不能精确报告PIK3CAp.E545K和p.H1047R突变。AmoyDxPIK3CA突变检测套件只能检测11个SOLAR-1热点突变中的5个，这意味着检测结果可能会忽略掉一些重要的突变，如PIK3CAp.C420R等。
肿瘤异质性的影响
在IQA和EQA中，部分样本显示PIK3CA突变状态存在肿瘤内异质性，这在HER2阳性和三阴性乳腺癌中更为常见。这种异质性可能影响突变检测的准确性，需要进一步研究。