瘤胃微生物对反刍动物营养代谢具有双重作用，一方面可以消化纤维素，利用非蛋白氮合成微生物蛋白，具有正向营养作用；另一方面能够降解蛋白质，快速发酵淀粉产酸产气，降低高品质饲料效能，具有反向营养作用。肉羊(Ovisaries)养殖生产中，养殖户常采用增加日粮精料水平的方法提高肉羊育肥速度(Maetal.,2021)，但粗饲料不足通常会引起反刍频次减少，瘤胃液pH降低，微生物区系改变，导致亚急性瘤胃酸中毒(subacuteruminalacidosis,SARA)和各类营养代谢疾病发生(常晓峰,刘大森,2021;侯志高等,2008)。所以研究瘤胃微生物多样性对于研究反刍动物营养和代谢具有重要意义。
基于此，本研究旨在探讨高精料日粮中添加不同种类、不同比例复合益生菌对湖羊瘤胃液pH、瘤胃微生物多样性的影响，为复合益生菌在肉羊养殖中的应用提供理论参考。
1、材料与方法
1.1实验处理
将60只80日龄左右、体重(23.0±3.0)kg的健康雄性湖羊(Ovisaries)羔羊随机分为4组(每组3个重复,每个重复5只羊)，对照组(CON)饲喂基础日粮，实验1、2、3组(G1,G2,G3)分别在基础日粮中添加2%、4%的复合益生菌FA1和2%复合益生菌FA2，复合益生菌FA1和FA2均购自陕西杨凌富仕特生物科技有限公司。实验期60d。基础日粮组成与营养成分含量见表1，日粮精粗比约为85∶15。2种复合益生菌的载体均为米糠，复合益生菌所含菌种的名称和含量见表2。样品中干物质、粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、钙、磷含量的检测方法分别参照中华人民共和国国家标准GB/T6435-2014、GB/T6432-2018、GB/T6434-2006、GB/T6433-2006、GB/T6436-2018、GB/T6437-2018。
1.2饲养管理
研究开始前对圈舍进行清理和消毒，对实验羊进行驱虫、疫苗注射并分组。实验日粮预试5d后开始正式实验。实验期每天投料2次(08:00和15:00)，自由采食，自由饮水。
1.3样品采样与指标测定
正式实验开始当天到第60天早晨饲喂前对实验羊进行空腹称重，每天记录采食量，计算实验期平均日增重(averagedailygain,ADG)和料重比(feedtogainratio,F/G)。在第60天获取每个圈舍的新鲜粪便，检测粪便中粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、钙和磷的含量。
在实验的第60天从每个重复随机选择2只羊，每组选择6只羊，晨饲前通过胃管抽取瘤胃液约50mL，取瘤胃液样品约5mL于10mL离心管中，用pH计(上海海恒机电仪表股份有限公司,RPB10型笔式pH计)测定瘤胃液pH。其余样品用于检测瘤胃微生物多样性。
1.4瘤胃微生物多样性检测
使用MagAttractPowerSoilProDNAKit(QIA‐GEN,德国)从24个瘤胃液样品中提取总基因组DNA，用引物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAG‐CAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTA‐AT-3')扩增细菌16SrRNA基因的V3～V4基因区。反应体系，5×FastPfuBuffer4μL,2.5mmol/LdNTPs2μL,10μmol/L上游引物338F和下游引物806R各0.5μL,FastPfuPolymerase0.4μL,BSA0.2μL，模板DNA10ng，用ddH2O补充至20μL。反应程序，95℃预变性3min;95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸45s，共27个循环；最后72℃延伸10min。使用紫外分光光度计(Nano‐Drop2000,Thermo,美国)进一步纯化和定量PCR产物。最后，使用Illumina公司的MiSeqPE300平台进行细菌16SrRNA测序(上海美吉生物医药科技有限公司)，主要测定样品中微生物的种类和丰度。
表1实验饲粮组成及营养水平(风干物质基础)
表2复合益生菌组成与含量
1.5数据处理分析
实验数据使用Excel2013进行汇总，使用SPSS22.0软件做数据分析，采用Duncan's法进行多重比较，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。所有测序数据在上海美吉生物医药科技有限公司云平台(cloud.majorbio.com)进行分析。
表3饲粮添加复合益生菌对湖羊生产性能的影响
2、结果与分析
2.1日粮添加复合益生菌对湖羊生长性能的影响
日粮中添加复合益生菌对湖羊生长性能影响的结果见表3。与对照组相比，添加复合益生菌的各实验组平均日增重有增加趋势，各实验组干物质采食量相比对照组均无显著变化，各实验组料重比均显著下降(P<0.05)。
2.2日粮添加复合益生菌对湖羊瘤胃pH的影响
日粮中添加复合益生菌对湖羊瘤胃液pH具有显著影响。对照组瘤胃液pH为(5.48±0.18)，实验1、2和3组的pH分别为(5.91±0.27)、(6.06±0.32)和(6.09±0.14)，均显著高于对照组(P<0.05)，各实验组之间无显著差异。
2.3日粮添加复合益生菌对湖羊粪便营养成分的影响
湖羊采食不同种类和比例复合益生菌60d后，各组粪便中粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、钙、磷含量见表4。由表4可知，4%益生菌FA1可显著提高粪便中粗纤维含量(P<0.05);2%益生菌FA2可显著降低粪便中粗脂肪和磷含量(P<0.05)。
2.4湖羊瘤胃液16SrRNA基因组测序分析
通过16SrRNA测序，获得原始序列(单端)共计1549094条，总的碱基数(单端)464728200bp；使用fastp(v0.19.6)软件分裂扩增子去噪算法(divi‐siveamplicondenoisingalgorithm,DADA2)进行降噪，物种注释数据库为silva138/16s＿bacteria，物种注释方法为贝叶斯算法，分类置信度为0.7，共获得优化序列1399397条，579264602个碱基，平均序列长度540bp。物种注释结果统计：界(King‐dom)1个，门(Phylum)10个，纲(Class)15个，目(Or‐der)28个，科(Family)45个，属(Genus)100个，种(Species)192个，获得扩增序列变体(ampliconse‐quencevariants,ASVs)数据集659个。后续数据分析均基于ASVs数据集。
表4饲粮添加复合益生菌对湖羊粪便中的营养物质含量的影响(风干物质基础,%)
2.4.1日粮添加复合益生菌对湖羊瘤胃菌群多样性的影响
通过稀释曲线分析chao指数图可知，抽取测序样本数量充足，测序数据可以进一步统计和分析(图1A)。Alpha多样性指数组间差异检验Shannon指数图显示，各组之间均无显著性差异(图1B)，表明添加复合益生菌对瘤胃菌群多样性无显著影响。Beta多样性属水平NMDS分析结果可知，分组椭圆面积CON>G1>G2>G3(R=0.0265,P=0.292)，即对照组、实验1组、2组、3组，物种组成相似度呈依次降低趋势(图1C)。
图1瘤胃菌群多样性分析
2.4.2日粮添加复合益生菌对湖羊瘤胃菌群组成的影响
由属水平物种维恩图分析结果(图2A)可知，70个菌属为所有样本共有，对照组特有的菌属有4个：红螺菌属(unclassifiedRhodospirillales)、乳头杆菌属(Papillibacter)、甲基戊糖梭菌(unclassifiedClostridium＿methylpentosum)、颤螺菌属(unclassifiedOscillospirales)，实验1组、2组、3组特有的菌属数量分别为3个(月形单胞菌(unclassifiedSelenomonadaceae),普雷沃氏菌(Prevotellaceae＿UCG-004),unclassi‐fiedUCG-010)、0个和3个(琥珀酸弧菌(Succinivibrionaceae＿UCG-001),丝状杆菌属(Fibrobacter)和巨球形菌属(Megasphaera))。
图2B目水平群落组成和丰度Bar图显示，各实验组与对照组相比，颤螺菌(Oscillospirales)丰度显著降低，实验2组毛螺菌(Lachnospirales)丰度显著升高，实验1组、2组梭菌UCG-014目(Clostrid‐ia＿UCG-014)丰度显著升高。
图2C属水平群落组成和丰度Bar图显示，瘤胃中丰度较高的菌属分别为普雷沃菌属(Prevotella)、沙特尔沃思氏菌属(Shuttleworthia)、解琥珀酸菌属(Succiniclasticum)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、欧尔森氏菌属(Olsenella)、梭状芽胞杆菌属(Clostridia＿UCG-014)，且各实验组瘤胃球菌属丰度均显著降低。
2.4.3日粮添加复合益生菌对湖羊瘤胃菌群差异性的影响
由各实验组瘤胃菌群比较分析(图3)可知，相比对照组，实验1组梭状芽胞杆菌属丰度显著升高，实验2组细小杆菌属(Solobacterium)显著升高，实验3组毛螺菌属(Lachnospirace‐ae＿NK3A20＿group)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)显著升高。实验1组相比实验2组丹毒丝菌(ErysipelotrichaceaeUCG-006)显著升高，实验1组和3组相比显著差异的菌属为梭状芽胞杆菌属，但2个组的梭状芽胞杆菌菌种不同。
图2瘤胃微生物群落组成分析
3、讨论
3.1日粮添加复合益生菌对湖羊瘤胃菌群组成及多样性的影响
图3各实验处理组瘤胃菌群比较分析
王磊等(2021)在肉牛日粮中添加益生菌发现，实验组和对照组肠道微生物群落Alpha多样性无显著差异，但2组样品分组聚类差异显著，这与本研究的结果是类似的，这可能是因为额外添加的复合益生菌抑制了瘤胃中一部分有害微生物的生长，但同时促进了另一部分益生菌的生长，例如本研究中添加的复合益生菌抑制了瘤胃中的颤螺菌属的生长，促进了毛螺菌的生长，且对照组、实验1组、实验3组均出现了数个特有菌属。Bate多样性NMDS分析发现，饲喂不同比例、不同种类益生菌60d后，对照组、实验1组、实验2组、实验3组物种组成相似度呈现梯度升高，同期3个实验组特有类群相比对照组均明显减少。这可能是由于添加的益生菌大量繁殖，其产生的代谢产物抑制了瘤胃中原有丰度较小的菌群的生长和繁殖。
4、结论
添加适宜的复合益生菌能够提高湖羊平均日增重、降低料重比(P<0.1)，提高瘤胃液pH(P<0.05)。本研究中添加不同种类和比例的复合益生菌剂分别显著提高了湖羊瘤胃梭状芽胞杆菌属、细小杆菌属、毛螺菌属和氨基酸球菌属厌氧益生菌的丰度。但4%高比例复合益生菌FA1对机体纤维降解具有负面作用。本研究为复合益生菌的应用方法和应用价值提供了参考。
基金资助:陕西省肉羊产业技术体系项目(NYKJ-2021-YL(XN)43;NYKJ-2022-YL(XN)46);“四主体一联合”陕西省校企联合研究中心项目;陕西省重点研发计划(2021ZDLNY05-02);国家绒毛用羊产业技术体系(CARS-39-12);
黄曲霉毒素B1(AflatoxinB1,AFB1)是对养殖业最具威胁的霉菌毒素之一，存在于谷物、油籽、坚果和香料等多种农作物中。AFB1污染属于全球性食品安全问题。肠道是AFB1进入机体后首先接触的生物屏障。被AFB1污染的食物或饲粮进入机体后可使肠道内氧化和抗氧化系统失调，进而导致肠道结构损伤。
生长激素(growthhormone,GH)是机体生长发育的重要调控因子，具有促进生长、调节物质代谢、影响生殖和免疫等生物学功能，主要体现在促进肌肉和骨骼等组织细胞的增殖和分化方面[4]。GH基因在组织和细胞中发挥作用，首先与靶细胞表面的生长激素受体(GHR)基因结合，由GHR基因介导将信号转入细胞内从而产生一系列的生理效应。
由于ADV具有宿主范围广、感染效率高、易于培养和纯化、基因结构稳定等优点，通过修饰ADV衣壳蛋白构建的ADV载体已被用于基因治疗及疫苗开发[2-3]。重组ADV载体也被应用于对抗人类或动物病毒性疾病[4]。关于CAdV、PAdV及FAdV-4研究较多，主要倾向于Fiber、Penton表达及单克隆抗体制备[5],对其余ADV的研究仍处于初步探索阶段。
在多羔母羊妊娠后期，由于日粮结构改变及胎儿增重，母羊激素水平、代谢状态及免疫机能都会出现较大波动，从而增加酮症、炎症性疾病及产前瘫痪等风险[2]。代谢组学是一门探究疾病成因、反映生物标志物、描述疾病及监测和预测复杂疾病的学科，其中包括对机体整体水平上代谢物变化进行定性或定量分析[3]。
作为一种典型的原核表达系统，改造后的大肠杆菌因生长速度快、连续发酵能力强和成本相对较低，被广泛作为外源蛋白表达的细胞宿主，而外源蛋白的表达形式主要分为可溶性和包涵体两种[8]。陈忠广等[9]利用稀释复性法探讨了不同条件对重组犬IFN-γ(rCaIFN-γ)蛋
从20世纪80年代初开始，猪流行性腹泻（PED）在我国传播并流行[1]。PED是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的传染性极强的猪肠道疾病。该病毒可影响所有品种和年龄的猪，并使其表现出不同程度的症状。其中，仔猪感染的死亡率高达100%，临床症状为急性衰弱性腹泻、呕吐和脱水[2]。
非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus,ASFV)能够引起家猪高热、皮肤发绀、内脏及淋巴结出血、呼吸困难、喜卧嗜睡等症状，最后导致急性死亡，病死率可达到100%。亚急性ASFV感染不会使猪群发生急性死亡，但致死率仍有30%～70%。慢性ASFV可以使少数猪感染，感染后活下来的猪终生带毒的概率为10%[1]。
赤羽病又称阿卡斑病，是由布尼亚病毒科正布尼亚病毒属的赤羽病病毒(AKAV)感染牛、绵羊、山羊引起的一种非接触性传染的病毒性反刍动物疫病，主要通过蚊虫和库蠓等媒介昆虫传播，也可通过子宫内感染垂直传播，临床上主要以怀孕母畜繁殖障碍以及新生动物关节弯曲和积水性无脑症为特征，因该病于1949年在日本群马县赤羽村发生而得名[1]。