在豆粕饲料加工生产中，通过有效的加工来降低或消除大豆蛋白的抗原性至关重要。在这其中，β-伴大豆球蛋白中β亚基热稳定性和酶耐受性最强，不易在加工过程中完全去除。研究表明，现如今已开发了多种加工方法和技术，例如热处理，酶水解，发酵和糖化等，但热处理时过度加热会降低赖氨酸和其他必需氨基酸的消化性，其他常规处理也难以有效除去抗原蛋白。微生物发酵可以去除抗营养因子和致敏蛋白，而不破坏豆粕的营养成分。同时，酶水解也是改变大豆蛋白结构和构象，降低其致敏性，改善其生化功能的有效方法。酶水解可以破坏蛋白质肽链，产生分子量较低的肽或氨基酸，改变过敏原的线性和空间表位，从而降低蛋白质的抗原性。枯草芽孢杆菌是一种常见的重要发酵剂，可产生各类酶，如碱性蛋白酶、淀粉酶等，利用枯草芽孢杆菌制备发酵豆粕，可将豆粕中的蛋白质水解成氨基酸和肽类等物质，显著降低致敏蛋白和抗营养因子。
本研究旨在使用纳米金适配体生物传感器评估豆粕发酵过程中的抗原蛋白含量，以β-伴大豆球蛋白的降解率为指标，通过单因素试验优化枯草芽孢杆菌等多种菌株、发酵方式、发酵酶等关键发酵条件，最终获得豆粕发酵的最佳工艺参数，并结合SDS-PAGE方法对比验证传感器检测结果的正确性。研究将为豆粕抗营养因子的降解与高值化利用以及纳米金适配体传感器在豆粕发酵生产中评估致敏蛋白的应用提供参考。
材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株
枯草芽孢杆菌10071（CICC10071）、枯草芽孢杆菌20522（CICC20522）、副干酪乳杆菌DY2（CCTCC2017303）、植物乳杆菌DY6（CCTCC2017138），中国典型培养物保藏中心；酿酒酵母BY4741、植物乳杆菌DY1、干酪乳杆菌DY13，实验室保藏。
1.1.2材料和设备
多功能检测仪，ST16R高速冷冻离心机，LF-Min-i4小型垂直电泳槽。
1.1.3培养基
枯草芽孢杆菌培养基(g/L:牛肉膏10.0，蛋白胨10.0，葡萄糖10.0，NaCI5.0，pH7.0，1×105Pa灭菌30min。
YPD培养基(g/L:酵母浸出粉10.0，蛋白胨20.0，葡萄糖20.0，1×105Pa灭菌30min。
MRS培养基(g/L:胰蛋白胨10.0，牛肉膏8.0，酵母浸出粉4.0，葡萄糖20.0，K2HPO42.0，
柠檬酸三铵2.0，乙酸钠5.0,MgSO4·7H2O0.58,MnSO4·4H2O0.25，吐温-801mL,pH6.3~6.5，1×105Pa灭菌30min。
1.2实验方法
1.2.1发酵菌株的选择
将实验室保藏菌种按照体积分数为1%的接种量接种到合适的培养基，在适宜培养温度下活化24h，按照同样的方式活化2~3代，继续于培养基中培养，得到发酵菌的菌液。
将豆粕与质量分数分别为50%的水、3%的糖及5%的所列发酵菌株对数期的菌液混合均匀后置于无菌处理的自封袋中，同时以不添加菌液组为空白对照，30℃培养箱中发酵120h。70℃烘干、粉碎，测定样品中β-伴大豆球蛋白降解率。
1.2.2发酵方式的优化
选取优化获得最佳菌株，将其按照体积分数为1%的接种量接种到培养基中，30℃活化24h，按照同样的方式活化2~3代，继续培养得到发酵菌液。
将豆粕与质量分数分别为50%的水、3%的糖及5%的菌液以及碱性蛋白酶（200U/g）混合均匀后置于无菌处理的自封袋中，分别做不添加菌液或蛋白酶的发酵组，30℃培养箱中发酵60h。70℃烘干、粉碎，测定样品中β-伴大豆球蛋白降解率。
1.2.3蛋白酶添加量的优化
控制水、糖蜜、及菌液的添加量不变，分别添加25、50、100、200、400U/g的蛋白酶37℃发酵60h，70℃下烘干、粉碎，测定样品中β-伴大豆球蛋白降解率。
1.2.4菌液接种量的优化
控制豆粕中的水、糖蜜及碱性蛋白酶的添加量不变，分别接种质量分数为2%、5%、7%、10%、20%、30%的菌液，30℃发酵60h、70℃烘干、粉碎，测定样品中β-伴大豆球蛋白降解率。
将豆粕与质量分数分别为50%的水、3%的糖及7%的菌液以及碱性蛋白酶（200U/g）混合均匀后置于无菌处理的自封袋中，30℃培养箱中发酵12、24、36、48、60、72、84h。70℃烘干、粉碎，测定样品中β-伴大豆球蛋白降解率。
1.2.7SDS-PAGE验证
将1.0g豆粕样品溶于15mL裂解蛋白溶液(0.03mol/LTri-HC1，15g/LSDS，0.1mol/L亚硫酸钠)，反应2h，12000r/min离心7min后取上清液。采用10%聚丙烯酞胺分离凝胶进行电泳。在电泳前，将上清液与样品加载缓冲液(5X)在水浴下加热10min。转移到每个孔中的蛋白质分散体的量约为10μL，用考马斯亮蓝R-250染色显示蛋白条带。
1.2.8氨基酸含量检测
称取1.0g豆粕于具塞试管中，加入质量浓度为5%的三氯乙酸定容至25mL，常温超声20min后静置2h，用双层滤纸过滤。取1mL澄清滤液，15000r/min离心30min，上清液用0.22μm水膜再次过滤，使用Agilent1260氨基酸专用高效液相色谱仪检测。
1.2.9有机酸含量检测
结果与分析
2.1发酵菌株的选择
微生物发酵能有效消除豆粕抗营养因子，并通过产生蛋白水解酶将豆粕中的大分子蛋白降解为易吸收的小分子蛋白，提高营养价值。常见的豆粕发酵所用菌种包括枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母等。比较不同菌株固态发酵降解豆粕β-伴大豆球蛋白β亚基的效果，如图1-a所示，固态发酵豆粕120h后，枯草芽孢杆菌20522发酵的豆粕的蛋白降解率可达41.08%，其次是枯草芽孢杆菌10071，为34.86%。整体来看枯草芽孢杆菌在降解致敏蛋白方面的效果优于酿酒酵母、植物乳杆菌等。同时，图1-b的SDS-PAGE结果显示，两组枯草芽孢杆菌发酵豆粕的β亚基条带相对更浅，降解程度更高，而a亚基也部分降解。通过图1-c目的蛋白条带灰度的归一化分析来看，枯草芽孢杆菌且尤其是20522菌株的目的蛋白占比最低，说明其含量低、降解度更高，这与传感器的检测结果相似。
近年来国内外对于不同菌种发酵豆粕的研究显示，不同菌种降解抗原蛋白的效果与其最适生长环境和分泌的蛋白酶有关，枯草芽孢杆菌往往在固态发酵条件下占据优势。研究发现从枯草芽孢杆菌中分离的碱性蛋白酶可使β-伴大豆球蛋白抗原性有效降低。枯草芽孢杆菌的碱性蛋白酶被归类为丝氨酸肽酶，其水解位点是疏水氨基酸的碳末端，可通过破坏抗原蛋白的空间结构和表位构象，使其降低或失去与特异性抗体结合的能力。因此，选择枯草芽孢杆菌20522作为最佳发酵菌。
2.2发酵方式优化
菌发酵、酶发酵和菌酶协同发酵是常见的豆粕固态发酵方法。除了微生物发酵，添加外源酶也可以促进大豆蛋白活性等抗营养因子的降解。众所周知，酶解不仅破坏蛋白质的一级结构，而且对破坏其高级结构具有显著作用。根据报道，酶水解脱脂大豆粉蛋白会降低其致敏性，最适合用于此目的的酶是碱性蛋白酶。但单纯通过酶水解生产的小肽具有明显苦味，生产成本高，限制了其开发利用。
如图2-a所示，菌酶协同组发酵豆粕的β-伴大豆球蛋白β亚基的降解程度最高，可达51.35%，其次是酶发酵，降解率为45.61%。而菌降解蛋白在固态发酵过程中效果一般，表明蛋白酶是影响发酵过程中蛋白降解的主要因素。从图2-b的SDS-PAGE的验证结果可以看出，菌发酵的豆粕蛋白条带比较完整，酶发酵和菌酶协同发酵豆粕的蛋白条带大部分已经降解，通过图2-c灰度分析的结果显示，蛋白含量从小到大依次是菌酶协同发酵(0.38<酶发酵（0.43<菌发酵0.86），这与纳米金适配体传感器检测结果的趋势基本吻合。据研究报道，菌酶协同发酵可以利用微生物分泌的酶系与外加酶共同作用处理豆粕，同时添加的蛋白酶大大提高了发酵培养基的整体蛋白酶活性，促进了发酵微生物的生长、酶的分泌和糖的代谢，提高了发酵效率和质量，这与本实验结果一致。
2.3酶添加量优化
发现，发酵过程中蛋白酶的活性主要受微生物分泌蛋白酶的量、pH值、微生物分泌的酶对蛋白酶的降解以及某些酶抑制成分等因素的影响。在菌酶协同发酵工艺条件下，图3-a中随着碱性蛋白酶酶量的增加，β-伴大豆球蛋白β亚基的降解率呈上升趋势。其中，50~200U/g添加量间的降解效率提升最为明显，在此区间内酶解底物是过量的，加酶量越多，酶解反应产物就越多。此后随着酶添加量增加，降解程度变化较小，说明酶解底物反应趋于饱和，添加过多蛋白酶并没有较好的降解效果，还会造成蛋白酶的浪费。经过60h发酵，200U/g酶添加量组豆粕β-伴大豆球蛋白降解率可达61.94%。SDS-PAGE验证结果显示，随着酶量的增加，β-伴大豆球蛋白β亚基条带逐渐变浅，当酶量≥100U/g时效果更为明显。因此，选择200U/g作为碱性蛋白酶的最佳添加量。
2.4菌液量优化
由图4可以看出，随着枯草芽孢杆菌20522接种量的增加，发酵豆粕的β-伴大豆球蛋白降解率呈现先增加后下降的趋势。当枯草芽孢杆菌接种的质量分数为7%时，降解率最高达到62.78%；当枯草芽孢杆菌接种的质量分数大于10%时，发酵豆粕的β-伴大豆球蛋白降解率反而呈现下降的趋势。在类似的枯草芽孢杆菌和中性蛋白酶协同发酵豆粕的研究中，也存在随着菌液接种量的增加，发酵豆粕肽含量先增加随后下降的现象，这可能是因为小肽含量先随发酵降解蛋白而增加，随后被又分解成更小的片段而导致出现下降。常见的豆粕发酵工艺中添加枯草芽孢杆菌菌液量大多在5%~15%。因此，选择7%作为枯草芽孢杆菌20522菌液量的最佳质量分数。此外，在β-伴大豆球蛋白降解程度较高时，从SDS-PAGE的电泳图难以观察出各个实验组之间的差别，而纳米金适配体传感器的检测结果则能够清晰、灵敏的反映出各实验组豆粕的β-伴大豆球蛋白的降解率。
2.6豆粕发酵前后指标分析
2.6.1游离氨基酸含量
2.6.2有机酸含量
有机酸作为畜禽的饲料添加剂，可直接参与机体能量、结构和酶促反应，还可以调节肠道菌群，抑制有害细菌的生长，延长发酵后豆粕的保质期。微生物发酵是产生有机酸的有效途径，HENG等研究发现添加的蛋白酶能有效地促进糖代谢，分泌更多的有机酸，引起的pH值下降还可以防止腐败和病原微生物增殖。如图7所示，经过菌酶协同发酵处理后的发酵豆粕中各项有机酸指标均有所提高。根据毛银等研究，发酵豆粕中的酸谱根据发酵工艺的不同有较大的差别，主要以乳酸、乙酸和柠檬酸这3种有机酸为主。枯草芽孢杆菌和碱性蛋白酶协同发酵豆粕中含量最高的是柠檬酸，由原来的2.68%提高到5.54%。乳酸也是衡量豆粕质量的重要指标之一，其具有维持动物肠道菌群平衡，减少腹泻，促进钙质的吸收等功能，豆粕经过发酵后乳酸含量达到1.62%，提高了17.72倍。乙酸含量达到1.01%，其作为抗微生物剂、酸度调节剂和酸味剂，提高了饲料的适口性。除此之外，发酵还产生了丙酸和苹果酸，含有多种有机酸的豆粕可以有效的抑制肠道内腐败菌生长，提高机体的免疫力。
结论
【原料组成】酵母菌、芽孢杆菌、乳酸菌、米曲霉等，糖化酶与复合酶制剂与载体等。
【产品成分分析保证值】酵母菌、芽孢杆菌、乳酸菌等合计≥100亿cfu/g，水分＜9.0%。
净重：200克/袋。
本产品是在活力99生酵剂的基础上的升级产品，升级了増香增甜等功能效果。
鉴别本产品真假与效果的简单方法：500毫升左右的矿泉水瓶子中放入约50克大米+300毫升35℃左右的温水，加入本产品5克，几个小时就会产生大量香醇气体，72小时内大米基本溶解为乳状。做试验时请切记要注意矿泉水瓶炸开的安全。
（一）制作加强型活性EM菌液
在非金属容器中将本品1包（200克）与1公斤红糖（也可以用5公斤大米或玉米等含淀粉类的饲料代替）放入约50公斤温水中，简单密封48小时后就变成了加强型活性EM菌液（每毫升活菌在100亿左右）。其使用方法如下：
1.在畜禽上的使用方法：根据不同动物与饲养周期按其饲料重量的0.1%-0.5%拌入饲料或饮水中后饲喂或饮用。
2.养殖场紧急除臭生物消毒：取加强型活性EM菌液兑水30倍清水，对产生臭味与异味的养殖区域、粪污水道、粪堆、污水池进行喷洒，以喷洒表面湿润为准，接待参观前1-3小时补喷一次效果更好。
3.制作青贮饲料：每吨青贮饲料中加入10公斤加强型活性EM菌液，简单喷洒在料上压实密封发酵15天以上。
4.养殖水产上的使用：每亩使用5公斤加强型活性EM菌液进行喷洒，晴天进行喷洒后注意增氧。
（二）制作各种发酵饲料
本品能够发酵木薯渣、豆渣、米粉面条加工下脚料、剩菜剩饭、米糠、统糠、菌糠、酒糟、果渣果皮、青黄秸秆、牧草、红薯藤、轻度霉变饲料等各种廉价饲料（下脚料）、各种饲料原料与全价饲料等，每500公斤待发酵原料加入本品1-2包（或50公斤上述加强型活性EM菌液）、20公斤以上的玉米粉或其它含淀粉类的饲料原料、1公斤食盐（含有足够食盐的原料就不添加），含水量调节到约60%，压实密封发酵2-7天左右有浓郁香味时即可使用。发酵后饲料的适口性、营养、消化率较未发酵前有明显提升。发酵后的饲料根据不同动物与不同饲养周期按照10%-50%与该动物其它全价饲料混合后饲喂（先少量饲喂适应后逐渐增加的原则），不可以单独饲喂或全部饲喂发酵饲料。
（三）发酵水产动物饲料成高浓度乳酸菌保健品
①部分发酵饲料运用：100公斤水产饲料、50公斤清水、本品1包密封发酵7天以上变成高浓度乳酸菌发酵饲料，以10%比例与水产动物饲料混合后饲喂，或者发酵饲料单独饲喂；②全部发酵饲料饲喂：也叫轻度发酵饲料技术，300公斤水产全价饲料、本品1包、水120公斤混合发酵24小时全部饲喂，这种预消化结合大量乳酸菌饲喂能够显著改善水产动物肠道健康、水质改善等优点。
（四）发酵部分禽粪做饲料
发酵鸡粪（鸽子粪、兔粪等）作猪、鱼等动物饲料，本品2包、100公斤玉米粉其它含淀粉类的饲料原料、500公斤鸡粪，加入适量麦麸或米糠调节含水量约为55%-60%，覆盖薄膜进行发酵，一周左右有浓郁香味时即可使用，可代替饲料20%左右，用于喂猪或鱼类等。
（五）发酵菜粕、棉粕、花生饼、茶枯脱毒
原料1000公斤，玉米面其它含淀粉类的饲料原料100公斤，食盐2公斤，含水量调节到55%左右，本品2包，简单地搅拌均匀，密封发酵15天以上成为高浓度乳酸菌小肽丰富的生物蛋白饲料，喂前摊开透气10分钟再作为蛋白质原料使用于自配饲料中，可以等蛋白代替豆粕和玉米粉如：17%的发酵菜粕=10%的豆粕+7%的玉米粉，降低成本提高使用效果。
（六）中草药及中药渣发酵方法
1.固态中草药发酵技术：将50公斤中草药粉碎，越细越好放入40公斤的35℃左右的温水中，加入玉米粉与豆粕各5公斤、本品1-2包、食盐100克，放入塑料容器内压实密封发酵7天以上后使用，密封可以保存一年以上，按照饲料比例的1%以上添加到饲料或饮水中使用。
2.液态中草药发酵技术：1公斤中草药+1包本品+1公斤红糖+20公斤清水混合在非金属容器中简单密封发酵72小时以上后使用。每吨饲料中添加10公斤或每吨饮水中添加5公斤。
（七）直接拌料或饮水、制粒饲喂、制作水料
根据不同动物在每吨饲料添加本品2-4包，直接拌料或每包加入1.5-2吨饮水中使用；本产品采用微生物多层包被技术，在每吨3包本品混合饲料中直接制粒，90℃下5分钟不会影响效果；动物采用水料水料（粥料）的制作：本品1-2包、500公斤全价饲料、1000公斤清水混合后发酵6小时以上后饲喂（预消化的轻度发酵模式），24小时内饲喂完。
2020年已全面禁抗，我们之前经常在饲料中添加的抗生素进行促生长行为将是违法，否则面临巨额罚单。如何既能够促进动物生长又能够形成无抗养殖呢？其实中草药在促进畜禽养殖健康和生长、改善肉蛋奶品质大有可为，特别是将中草药发酵后效果提升4-28倍等好处，这个实施方案比你想象中效果更好，运用的没有不被效果折服的，值得尝试验证
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