随着基因工程的不断发展,对重组性治疗蛋白的需求大幅度增长。治疗性单克隆抗体(monoclonalantibody,mAb)作为一种重要的重组蛋白具有特异性和免疫原性小等特点,近年来发展迅速,己成为肿瘤、免疫系统疾病等多种疾病的前沿治疗药物。近几年，平均每年有15种以上重组蛋白新药通过美国食品和药物管理局(FDA)批准，并且在几个重磅生物抗体药专利即将到期促使生物仿制药出现的刺激下，全球生物抗体药销售额已超过1800亿美元每年。
在抗体药物生产中，上游构建表达过程尤为重要，关系到整个抗体药物的质量及药效，我们从单克隆抗体药物工业生产中宿主细胞选择、表达载体构建、转染方法、筛选技术、细胞培养工艺技术方法以及最后选定细胞株的标准等，结合单抗药物CHO细胞株开发和培养工艺的经验，对当前我国单抗CHO细胞株开发技术策略进行了探讨。
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宿主细胞
哺乳动物细胞是临床抗体药物产品使用的主要表达系统。对于治疗性抗体而言，为了满足其生物活性，需要进行正确的折叠和翻译后修饰，因此用于生产治疗性抗体的宿主细胞往往是哺乳动物细胞，主要包括：Sp2/0骨髓瘤细胞、NS0小鼠骨髓瘤细胞、HEK293人胚胎肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞（Chinesehamsterovary，CHO），其中以CHO细胞用途最为广泛。
与其他表达系统相比,CHO表达系统占有很大优势:(1)更适用于悬浮培养,可以满足大规模工业生产重组蛋白的要求；(2)产生的抗体分子在结构、功能方面和天然抗体分子较接近；(3)所含人类病毒极少；(4)外源基因可以在CHO细胞中稳定地整合；(5)CHO细胞是成纤维细胞,几乎不分泌内源性蛋白,因此对目标重组抗体的分离纯化工作十分有利。
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表达载体的构建与转染
生产用稳定细胞株的构建首先由表达载体的构建和细胞转染开始，将表达抗体的目的基因构建到载体上，再将该载体转染进入宿主细胞内。常见的转染方式主要有磷酸钙转染、电穿孔转染、脂质体转染和逆转录病毒转染。DNA进入宿主细胞核后将会随机整合到宿主细胞基因组中，因此其表达水平与基因拷贝数、基因整合位点的转录活性有关。然后，不同筛选试剂将被用于筛选能够正确表达目的基因并且高水平表达的细胞池。由于此时得到的细胞池中的每个细胞特性各异，具有不同的基因整合位点、拷贝数、细胞单产和生长速率，因此需要将其中具有高产、稳定表达特性的细胞个体分离出来分别培养，通常需要获得数百甚至上千的候选克隆供进一步筛选。被筛选出来的克隆经过传代培养和分批补料（fed-batch）实验，比较其生长特性、代谢状况、表达量高低、表达产物质量等因素，选出最优的几个克隆进入生物反应器放大实验，最终确定生产用单克隆细胞株。如下图。
适合于CHO细胞表达的载体(Vector)的基本元素包括:启动子(promoter)、polyA加尾信号(polyAsignal)、筛选标记(selectablemarker)、克隆位点(cloningsite)和复制起始位点(originofreplication)，有些还有报告基因(reportergene)。启动子一般较多采用SV40和CMV两种，CMV启动子通常位于目的基因(轻链和重链可变区基因)之前，而SV40则位于筛选标记之前。筛选标记一般有两种：代谢型和抗生素型，或者也可称为扩增型基因筛选标记和非扩增型基因筛选标记。常见的筛选标记见下表，当前工业界较多采用的筛选标记为DHFR、GS、G418和puromycin等。
哺乳动物细胞表达载体中常用的筛选标记
目前，商业中所选择的载体供应商主要是Lifetechnologies公司，从pcDNA3系列到FreedompCHO1.0,其大小由原来的4000～5000bp到现在的近13000bp不等。pcDNA3.1是Lifetechnologies公司早期开发的载体,其构造相对较简单。pOptiVEC-TOPO载体的最大特点在于具有TOPO酶和IRES(internalribosomeentrysite)组件，TOPO酶具有无缝克隆的特点，与多克隆位点相比，优势在于插入目的基因时不会带有酶切位点,而IRES组件的功能主要是能够将它所连接的两个基因共用同一个启动子进行表达。
MTX是DHFR的特异性抑制剂。当宿主细胞是DHFR-，如CHO-DG44，转染的载体上含有DHFR基因，MTX能够促使细胞增加包含DHFR基因和目标蛋白基因在内的基因拷贝数。通过不断增加MTX的浓度可以逐步增加拷贝数，直到随着MTX浓度的增加，拷贝数不发生明显改变，即拷贝数不再变化。在载体构建的过程中，可以使用较弱的启动子来弱化DHFR基因的表达或者改造DHFR的基因使之不稳定，从而增加MTX的筛选扩增效果。
另一方面，插入染色体的位置也影响着真核基因的表达，即“位置效应”。当外源基因插入异染色质及其附近区域产生位置效应时，此处异染色质区域将产生位置效应斑点，此时，周围的异染色质将有效地阻止插入基因的表达。为了克服“位置效应”，一般有两种办法：将目的基因定点整合到合适的位点，或者在目的基因的侧翼加上“绝缘子”DNA序列，从而抑制“位置效应”。
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转染方法
转染类型一般有稳定转染和瞬时转染两种。在单抗细胞株筛选稳定转染前通常通过瞬时转染得到一些抗体，进行质量分析，以初步判断抗体是否满足需要，或者进行一些前期的启动子、密码子等组件的优化。稳定转染中外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体存在。在CHO细胞中进行稳定转染时，外源DNA整合到CHO染色体上，未整合的游离态的DNA会随传代而丢失。
常用于哺乳动物细胞转染的方法有磷酸钙法、阳离子脂质体法、阳离子聚合物法和电穿孔法，使用最多的是阳离子脂质体法和电穿孔法。
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高表达细胞株的筛选
筛选高表达单克隆细胞株是细胞株构建的关键步骤，衡量标准包括抗体表达量、产品质量、代谢稳定性、细胞稳定性等。当目的基因被转染到宿主细胞内，并按照一定的细胞密度在合适的筛选压力下进行传代培养后便得到了细胞池。细胞池的表达量取决于转染的方式、筛选压力的作用以及目的基因整合情况。由于目的基因整合具有很大的随机性，即使用相同的方法进行转染和筛选，表达量依然会体现出极大的差异性，接下来就要从细胞池中筛选出高产稳定的细胞株。
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筛选准则以及检测方法
克隆在摇瓶考察后，需要选定一定数量的克隆进入反应器进行评价，主要考察细胞生长、单抗表达和单抗质量等。一般筛选克隆会做1～2次亚克隆，以确保是单克隆。当然如果在初期母克隆筛选的时候能够确保是单克隆，可以不做亚克隆。
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细胞培养工艺的优化
细胞株开发的过程中，一般需要在一定的培养工艺平台基础上进行克隆筛选。中试生产申报药品临床试验(investigationalnewdrug，IND)时，一般会选定2～3个来自不同系列的克隆，其中1～2个克隆作为备选。
培养工艺对最终生物制品的产量、质量和安全有巨大影响，其中以细胞培养基的选择最为重要。在筛选培养基和补料培养基时，初期流加培养时基础培养基和同品牌的补料培养基应该配对进行筛选。初步筛选之后，将基础培养基和补料培养基进行分类，如促进生长类型、维持活率类型、促进表达类型等。将培养基进行混合优化时，尽量将不同类型的培养进行组合，并且应用实验设计(designofexperiment，DOE)优化。
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参考文献：
［3］RobinsonMP,KeN,LobsteinJ,PetersonC,SzkodnyA,MansellTJ,etal.Efficientexpressionoffull-lengthantibodiesinthecytoplasmofengineeredbacteria.NatCommun2015;6:8072.
［4］YouM,YangY,ZhongC,ChenFT,WangX,JiaTR,etal.EfficientmAbproductioninCHOcellswithoptimizedsignalpeptide,codon,andUTR.ApplMicrobiolBiotechnol2018;doi:10.1007/s00253-018-8986-5.
［5］LaiT,YangY，NgSK.Advancesinmammaliancelllinedevelopmenttechnologiesforrecombinantproteinproduction［J］.Pharmaceuticals(Basel),2013，6(5):579－603．
［6］LiJ,WongCL,VijayasankaranN,etal.FeedinglactateforCHOcellcultureprocesses:impact>［7］MartinM,HolmesFA,EjlertsenB,etal.Neratinibaftertrastuzumab-basedadjuvanttherapyinHER2-positivebreastcancer(ExteNET):5-yearanalysisofarandomised,double-blind,placebo-controlled,phase3trial.LancetOncol,2017,18(12):1688–1700.
［8］WellsE.Cellularengineeringfortherapeuticproteinproduction:productquality,hostmodification,andprocessimprovemen.BiotechnolJ2017;doi:10.1002/biot.201600105.
［9］LaiT,YangY,NgSK.Advancesinmammaliancelllinedevelopmenttechnologiesforrecombinantproteinproduction.Pharmaceuticals(Basel)2013;6(5):579-603.