1、文献综述血管钙化动物模型的研究进展段晓辉1,齐永芬1,2综述,唐朝枢1,2审校(1.北京大学第一医院心血管病研究所,北京市100034;2.北京大学医学部生理学与病理生理学系,北京市100083关键词医学实验动物学;血管钙化;动物模型;药物诱导;慢性肾功能衰竭;基因敲除;高脂饮食摘要血管钙化是临床上多种疾病共有的病理表现,为阐明其发病因素和发病机制,有赖于可靠、稳定的动物模型。常见的制备动物血管钙化模型的方法有药物诱导、慢性肾功能衰竭、基因敲除和高脂饮食近交培育四种,各有其适用范围和局限性。本文对近年来血管钙化动物模型制备的研究进展作简要综述。中图分类号R332文献标识码A血管钙化是动脉粥样硬
3、转运体开放,增加细胞内的磷水平,诱发凋亡,产生凋亡小体和基质囊泡,使VSMC向成骨细胞样表型转化。目前认为许多因素都参与了血管钙化的发病过程,提出了骨形成蛋白调节学说、细胞控制学说、凋亡体基质囊泡学说和氧化应激学说等多种假说,但这些学说均不能完全说明血管细胞向骨细胞表型转化的机制,难以解释临床常见血管钙化与骨质疏松并存的现象。目前常用来诱导在体血管钙化的实验动物有小鼠、大鼠、兔和微型猪等,最常用的鼠血管钙化模型的方法主要有药物诱导、慢性肾功能衰竭、基因敲除和高脂饮食近交培育等4种。现将近年来血管钙化模型制作的研究进展简述如下。1药物诱导维生素D3、华法令、尼古丁、氯化钙单独或联合应用均可诱
5、人体,用中毒剂量的维生素D3可诱导出现高钙血症、高钙尿、食欲不振、恶心、昏迷、异位软组织的钙化、肾钙质沉着及肾功能衰竭。中毒剂量的维生素D3诱导动脉弹力层钙化已有70余年的历史。维生素D3能够有效促进骨的重吸收,使血清钙水平升高30%以上。Price等2报道给7周龄雄性SD大鼠皮下注射维生素D350万单位/(kgd,持续3d能使大鼠出现广泛的主动脉、股动脉、肠系膜动脉、肝动脉、肾动脉和颈动脉的钙化,血清钙水平上升30%以上。但这种血管钙化大鼠同时并发肺、气管、肾、胃、小肠等脏器广泛钙化。但这种钙化模型难以模拟临床血管钙化的病因,因为机体存在对维生素D3摄取和代谢的稳态调节,除医源性
6、外,自然病程很难使体内维生素D3的蓄积量达到这种诱导剂量3。1.2华法令诱导华法令是维生素K的抑制剂,在临床上作为抗凝剂广泛用于治疗血栓性疾病。依赖维生素K1的基质Gla蛋白(matrixGlaprotein,MGP羧化后产生的羧化基质Gla蛋白是血管钙化的抑制因子,华法令通过拮抗维生素K1而抑制羧化基质Gla蛋白的生物合成发挥其致动脉钙化的作用。Price等给6周龄雄性SD大鼠每12h背部皮下注射华法令150mgkg,同时为有效防止华法令引起的出血,每天再给予维生素K115mgkg连续3周即可诱导动脉中膜弹力层钙化4。这种模型显著增加了钙化血管
7、的MGPmRNA和蛋白质的水平但下调血清MGP水平,但不影响骨的生长和重吸收、体重的增加以及血清钙磷含量,且这种大鼠不出现骨量减少以及由此而产生的病理性骨折4。Price等5给20d龄的雄性SD大鼠华法令2周,主动脉中膜出现大量的局灶性钙化,但对6周龄的大鼠动脉钙化的诱导作用不明显;给予10月龄的大鼠华法令4周,检测不到动脉钙化。有趣的是给20d龄雄性SD大鼠限量饮食(<6gd下给予华法令也不能产生动脉钙化。这些结果表明华法令能否诱导产生血管钙化与大鼠的年龄和生长状况有关。1.3华法令和维生素D3的联用华法令和维生素D3的联用能明显增加动脉中膜弹力层钙化的范围。Pri
9、率为40%,在9d时所有动物全部死亡。1.4维生素D3和尼古丁联用Niederhoffer等6联用维生素D3和尼古丁制备出模拟衰老、终末期肾病和糖尿病血管病变的大鼠血管钙化模型。大剂量维生素D3可造成动脉组织钙含量增加,尼古丁可增强维生素D3的作用。上午9时给予两月龄的雄性Wistar大鼠肌肉注射维生素D330万单位kg和灌胃25mgkg尼古丁,当日下午6时再重复给尼古丁一次,两个月后发生了广泛的血管中膜钙化,伴有血管弹力蛋白降解,弹力纤维网的破坏,动脉壁的僵硬性增加,脉压升高和左心室肥大。大鼠收缩期血压显著升高伴左心室的肥大,可视为是收缩期高血压模型。实验室对8周龄雄性Wistar大鼠肌肉注
10、射维生素D330万单位kg,同时用尼古丁25mgkg灌胃,9h后再重复给予尼古丁1次。4周后大鼠出现广泛的血管钙化。钙化大鼠血浆钙含量、心率、平均动脉压无明显影响,可以作为一种稳定性高、重复性好的血管钙化的诱导方法7。但是VDN除诱导心血管组织钙化外,还伴有肾、肺、肠等多器官组织的钙超载。1.5氯化钙诱导Basalyga等8暴露成年SD大鼠的腹主动脉后,其外膜用浸有0.15molL氯化钙溶液的无菌纱布湿敷15min,7d后能明显诱导相应区域血管的钙化。钙化区域有弹性纤维降解、细胞外基质的结构破坏以及血管细胞中等程度的凋亡,但不会出现由更高浓度氯化钙诱导血管钙化时所伴有的动脉瘤和炎症反应的发
11、生。Longo等9发现在此过程中基质金属蛋白酶2(matrixmetalloproteinases2,MMP22和MMP29降解弹力蛋白,易产生腹主动脉瘤。而MMP22基因敲除(MMP22-/-和MMP29基因敲除(MMP29-/-的小鼠能对抗氯化钙所诱导血管损伤,不产生弹性蛋白的降解和血管钙化,所以氯化钙诱导血管钙化的机制与钙在弹力纤维上的沉积和MMP介导的弹性蛋白的降解有关。与此机制相似,Bailey等9在35周龄SD大鼠背部前后皮下植入两个1015mg纯化的弹力蛋白移植物,3周后取出发现移植物发生了钙沉积。2慢性肾病大鼠血管钙化血管钙化是慢性肾病(chronicki
12、dneydisease,CKD的并发症之一,CKD大鼠的主动脉中膜钙化,这与CKD产生的继发性的甲状旁腺功能亢进和骨代谢紊乱有关。2.1维生素D3联合肾次全切除术Tamura等10对9周龄Wistar大鼠行左肾切除术1周后再切除右肾的23,其生存率可达95%,在高钙(4%高磷(1.8%饮食喂养下,给予1,252二羟维生素D31g(kgd溶解在芝麻油中灌胃3周,可以出现动脉中膜的血管钙化。慢性肾病时易并发高磷血症,导致血管钙化的发生。Jono等体外培养人VSMC发现磷以剂量依赖的方式增加VSMC的钙化,同时增加钙化区钠磷共转运体(Pit21的表达。磷亦能促进核心结合因子21的活性以
13、及其下游的成骨细胞分化标志物骨钙素的表达。在软骨细胞中钙化的VSMCs所释放的高磷负荷的基质囊泡亦发现有钠磷共转运体的存在,推测磷通过Pit21转运至VSMC内诱导VSMC转化为成骨样细胞而导致血管钙化的发生。2.2腺嘌呤喂养产生高甲状旁腺激素血症血管钙化Tamagaki等11给予8周龄雄性SD大鼠含0.75%的腺嘌呤饮食持续4周后即可产生慢性肾功能衰竭,表现为继发性甲状旁腺功能亢进症,甲状旁腺增生,血中甲状旁腺激素急剧升高。钙磷代谢严重紊乱,骨的再吸收作用增强,主动脉、冠状动脉以及其他软组织的钙化形成。主动脉钙化主要出现在中膜,与临床上典型的慢性透析病人动脉钙化极为相似,另外,在其
14、胃粘膜固有层和肌层可以检出转移性钙化病灶。其可能原因是高浓度腺嘌呤严重损害了肾脏的正常生理功能,甲状旁腺激素升高,血肌酐和无机磷酸盐增加,血清钙的水平下降,但钙磷乘积升高,最终肾功能衰竭,钙盐在血管等软组织沉积所致。3基因敲除基因敲除小鼠血管钙化模型是利用转基因技术,把对血管钙化有抑制作用的基因缺失或替换以制备血管钙化的小鼠模型。这种方法排除了饮食和药物诱导血管钙化时所伴随的副作用和复合因素,但是其制备过程复杂,需时长,成本较高。3.1基质Gla蛋白缺陷小鼠基质Gla蛋白(MGP是一种由84个氨基酸残基组成的分子量为14kDa的细胞外基质蛋白,主要在肾脏、心脏、软骨、VSMC、内皮细胞
15、和巨噬细胞等部位表达。在辅助因子维生素K1的存在下,2谷氨酸羧化酶可将无活性的谷氨酸残基羧化为有活性的Gla残基,具有5个Gla残基的MGP与羟基磷灰石具有高度亲和力,可抑制钙沉积及羟基磷灰石晶体增长从而抑制血管钙化。Robicsek等12发现MGP-/-小鼠可产生广泛的动脉弹力层钙化,包括主动脉及其大的分支、所有弹性动脉和肌肉动脉,同时冠状动脉内弹力层和气管、小支气管软骨钙化,伴随主动脉的软骨性化生,表现为软骨性基质型胶原蛋白聚糖的出现。动脉的管壁僵硬,脆性增大,易于破裂。该模型小鼠出生后1周出现动脉中膜钙化,两周时变化明显,3周时中膜全部钙化,两个月时常因主动脉破裂死亡。其机制可
16、能是MGP与骨形态发生蛋白2(bonemorphogeneticproteins2,BMP22相结合阻断了BMP22的作用,而MGP-/-小鼠不能抑制BMP22的成骨活性而导致血管钙化的发生。近来研究还证实,脉管系统中MGP组织特异性敲除的小鼠如果再恢复表达MGP则可阻止血管钙化的发生13。3.2骨保护素缺陷小鼠骨保护素(osteoprotegerin,OPG是肿瘤坏死因子(tumournecrosisfactor,TNF受体基因超家族的成员,在软骨组织及动脉中均有表达,是一种能在体内外抑制破骨细胞发育的分泌性蛋白。生理状态下产生的OPG还能维持内皮细胞的生存,降低血管对
17、骨质的重吸收。Bucay等14制备的OPG-/-小鼠出现总的骨密度的下降和骨折发生率的升高,同时产生动脉内膜和中膜的钙化,在两周时出现,两个月时最为明显,但没有MGP-/-小鼠动脉钙化范围广泛,钙化主要发生在主动脉和肾动脉,在小动脉中不明显,伴有严重的骨质疏松,其病变还可以在内源性OPG产生的部位出现14。由于OPG能通过核因子B信号途径竞争性抑制骨保护素配体,OPG的缺失使其抑制骨保护素配体的作用消失而产生血管钙化。Orita等15最新发现,610周龄的雄性OPG-/-小鼠连续3d注射维生素D3后可见主动脉中膜VSMC胞浆和细胞外基质中严重的钙沉积,碱性磷酸酶(alkalinepho
19、究高胆固醇血症和As的斑块进展。Qiao等16研究发现载脂蛋白E-/-小鼠在As纤维帽形成后即可产生血管钙化,23的载脂蛋白E-/-小鼠在正常饮食下同时发生主动脉和冠状动脉的钙化。在高脂饮食下载脂蛋白E-/-小鼠可出现更为广泛的As和血管钙化。该模型广泛用于研究动脉粥样硬化和血管钙化的发病和治疗。Massy等17发现载脂蛋白E-/-小鼠在慢性肾功能衰竭后期出现的尿毒症症状能加速载脂蛋白内膜以及无动脉粥样硬化的血管中膜的钙化形成。3.4低密度脂蛋白受体缺陷小鼠低密度脂蛋白受体广泛分布于肝脏和动脉壁细胞的细胞膜表面,能特异性识别并结合LDL,其主要作用是转运肝脏合成的内源性胆固醇,LDLR缺陷
20、是引起家族性高胆固醇血症的重要原因。Towler等18用普通饮食喂养LDLR-/-小鼠并不能诱导产生肥胖、糖尿病、As和血管钙化,而给予810周龄LDLR-/-小鼠喂养导致糖尿病的高脂饮食(含1.25%的胆固醇和0.5%的胆盐,则能产生明显的主动脉钙化,表现为促进矿化和成骨分化的同源结构域转录因子Msx2、Msx1以及成骨细胞的基质蛋白骨桥蛋白(osteopon2tin,OPN的表达上调,vonKossa染色证明主动脉和动脉外组织中广泛钙沉积,表明导致糖尿病的饮食诱导LDLR-/-小鼠血管钙化是通过启动成骨细胞转录调节过程来实现的。3.5骨桥蛋白缺陷小鼠骨桥蛋白(OPN是一
21、种分泌型糖基化磷酸蛋白,在骨、软骨、肾、蜕膜和胎盘等组织中广泛表达,OPN能与存在于破骨细胞表面的整合素v3受体结合,酸化局部的微环境,使矿物质溶解,抑制羟基磷灰石结晶的生长,并分泌蛋白酶和水解酶,降解胶原和其它的骨基质蛋白,刺激破骨细胞的骨重吸收活性。OPN抑制血管钙化的作用可能是通过其转录后磷酸化修饰来实现的,未磷酸化的OPN则无此作用。SpeerMY等19研究发现OPN-/-小鼠破骨细胞功能异常,导致骨质的丢失,但是血管钙化的发生不明显。然而MGP和OPN基因双敲除(MGP-/-OPN-/-的小鼠在4月龄时动脉钙化的程度比单纯MGP-/-小鼠更为严重,组织学检查发现动脉弹力层断
22、裂、血管破裂并形成动脉瘤,同时发现这种双敲小鼠的VSMCs的标志物2actin丧失,致使VSMC的可塑性下降并转化为成骨样细胞最终导致血管钙化的发生。从主动脉的von2Kossa切片染色和钙化区域的定量分析表明,60周龄OPN-/-载脂蛋白E-/-小鼠比60周龄载脂蛋白E-/-小鼠具有更广泛的钙化面积20。3.6胎球蛋白A缺陷小鼠胎球蛋白A(Fetuin2A又称22Heremans2Schmid糖蛋白,是一种与矿物质具有高度亲和力的血清蛋白,是羟基磷灰石前体沉积的抑制因子,它可作为调理素促进细胞对细胞外不溶性钙的内吞作用。用电子显微镜和动态光散射实验观察发现,Fetuin2A能够与钙和
23、磷形成直径为30150nm的胶质状可溶性复合物从而抑制羟基磷灰石结晶的起始和初期合成,但是对已经形成的结晶体无作用。SchferC等21用含维生素D3的高钙高磷饮食喂养Fetuin2A-/-小鼠可自发性地产生严重的小血管、肾小管和肺泡的异位钙化,而有钙化倾向的DBA2小鼠的Fetuin2A缺失则出现严重的肾、心、肺、皮肤广泛的矿物质的沉积,伴有动脉血压的增高、肾功能衰竭、严重的蛋白尿、继发性甲状旁腺功能亢进症和骨质的减少,但未见大动脉的钙化。这可能与Fetuin2A-/-DBA2小鼠动脉壁中抑制血管钙化的因子MGP、OPN的mRNA和蛋白水平的上升有关。3.7Klotho基因缺陷(K
24、lotho-/-小鼠Klotho基因是Kuro2oM等22于1997年发现的能够抑制衰老的新基因,编码与2葡萄糖苷酶序列相似的一种膜蛋白,大部分在肾脏和脑组织表达。Kuro2o等通过插入突变培育成Klotho-/-小鼠,出现与人类相似的以寿命缩短为特征的衰老过程,包括动脉硬化、不孕、皮肤萎缩、骨质疏松和肺气肿,Klotho-/-小鼠于出生后4周就能产生进行性的动脉粥样硬化过程,随后出现中等大小的肌性动脉的中膜钙化及其内膜增厚,肾脏的小动脉也出现广泛的钙化。KohN等的研究发现,Klotho基因的缺失与慢性肾功能衰竭病人所出现的高磷血症和肾病性骨营养不良有关。尿毒症期的病人出现
25、衰老、动脉硬化的加速和异位钙化等症状,与Klotho蛋白产生减少而失去其保护作用有关。3.8Smad6基因缺陷(Smad6-/-小鼠Smad是转化生长因子(transforminggrowthfactor,TGF2骨形态发生蛋白(Bonemorphogenicprotein,BMP家族信号蛋白,包括8个成员,分别称为Smad18。分为三类:Smad1、2、3、5和8称为受体调节Smad,介导TGF2超家族的信号;Smad6和7称为抑制性Smad,抑制TGF2超家族信号的传导;Smad4为协同Smad,是受体调节Smad的协助信号蛋白。HruskaKA等研究表明BMP2
26、4能通过激活其下游的Smad15调控成骨细胞的分化和促进成骨的作用,而Smad6则通过抑制Smad15的活性而抑制所有BMP诱导血管钙化的信号传导通路;此外Smad6还能通过与BMP型受体的相互作用拮抗BMP诱导的成骨作用23。Smad6-/-小鼠心瓣膜形成障碍,6周时心脏附近的主动脉和肺动脉出现钙化,而且在主动脉的中膜发现软骨的化生和骨小梁结构的形成,可伴有骨髓的成分,与BMP22介导的软骨内成骨过程相似,但是有Smad6表达的VSMC处的骨形成受到抑制。同时内皮依赖的血管舒张功能下降,股动脉的平均动脉压升高24。3.9碳酸苷酶同功酶(carbonicanhydrase,CA缺陷(C
27、A-/-小鼠碳酸苷酶(carbonicanhydrase,CA能把二氧化碳(CO2和水转化成碳酸氢根(HCO-3和氢离子(CO2+H2OHCO-3+H+,通过细胞膜上的钠氢交换(Na+2H+使H+分泌到细胞外,从而调节CO2转运、pH稳态、骨的重吸收和尿素的生成等。Whyte等25发现CAII是碳酸苷酶家系的催化活性最强的同功酶,广泛分布于哺乳动物的骨、肾、脑等各组织细胞及红细胞胞浆内,尤以破骨细胞中含量最丰富。遗传学研究表明,CAII缺陷是一种常染色体隐性遗传病,临床表现为骨硬化症、肾小管性酸中毒以及大脑的钙化。由于骨的重吸收需要酸性的微环境,而破骨细胞中碳酸苷酶同功酶缺
29、钙化,在弹力层断裂处最为明显,伴有炎性的纤维增生反应和炎症介导的弹性组织溶解。9周时VSMC侵入内膜层并大量增生,弹力层变薄以至破坏消失,胶原、蛋白聚糖和弹力蛋白紊乱。内弹力层的断裂主要是由于内皮细胞的变性和中膜炎症细胞的浸润,外弹力层的破坏则是因炎症细胞和成纤维细胞在邻近外膜的聚集所致,这可能与局灶性的MMP29过表达降解了弹性蛋白有关。3.11核苷酸焦磷酸酶磷酸二酯酶1缺陷小鼠核苷酸焦磷酸酶磷酸二酯酶1(ectonucleotidepyrophos2phatasephosphodiesterase,NPP1能够水解ATP产生焦磷酸,从而抑制羟磷灰石结晶的形成。NPP1表达缺失,焦磷
30、酸的产生受到抑制,则不能抑制基质囊泡中羟基磷灰石结晶的形成,而且丧失其原本具有的局限基质囊泡和拮抗钙化的功能。先天性NPP1缺失会导致原发性婴儿动脉中层钙化征。Johnson等28发现C57BL6背景的NPP1-/-小鼠有软骨特异性基因的表达,上调碱性磷酸酶活性,下调生理性钙化抑制剂骨桥蛋白的表达;在主动脉组织内可见到软骨特异性胶原基因的表达,使血管等软组织发生广泛的钙化。3.12锚蛋白缺陷小鼠锚蛋白基因最先由HoAM等在2000年发现,定位于5号染色体短臂上,是脊椎动物中普遍存在的一段高度保守的基因序列,编码由492个氨基酸残基组成的多次跨膜蛋白,分子量为54.3kDa,可调节细胞内外
31、焦磷酸盐的水平。焦磷酸盐及其衍生物是软组织钙化的重要抑制因子,锚蛋白能够把细胞内的焦磷酸盐转运到细胞外,通过抑制矿物质的沉积而抑制钙化的发生。Johnson等28报道小鼠Ank基因敲除后产生了广泛的异位钙化,包括心、血管、脑、肝、脾、肺、骨骼肌,同时伴有骨关节炎的发生、骨赘的形成和关节的破坏。但是与NPP21-/-小鼠相比,锚蛋白缺陷小鼠的钙化程度要低一些,而锚蛋白和NPP21双敲除(锚蛋白缺陷NPP21-/-小鼠则出现更广泛的钙化29。4高脂、高胆固醇饮食喂养的近交系小鼠动脉粥样硬化常伴有血管钙化的发生,血管钙化增加动脉粥样硬化斑块的不稳定性和导致心血管事件的发生。QiaoJH等16实
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