以上研究均是针对高脂饮食对胃肠菌群多样性、特定蛋白或转录组表达进行的研究,那么高脂饮食对胃组织的蛋白质表达水平有怎样的影响呢？在本研究中,我们以C57BL/6小鼠为研究对象进行连续110d的高脂饲料喂养,把整体胃组织在前胃、胃体和胃窦3个区基础上进行蛋白质质谱鉴定,并从整体上和胃分区两个方面对差异蛋白进行GO生物功能富集及相互作用网络分析,首次从蛋白质组层面研究了高脂饮食对胃组织蛋白质组表达水平的影响。
纯系雄性6周至8周龄C57BL/6小鼠10只,体重(20±2)g,SPF级,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2012-0001。
高脂饲料购自ResearchDiets公司,PBS购自Gibco公司,尿素和质谱级去离子水购自J.T.Baker公司,蛋白酶抑制剂购自Thermo公司,FASP管购自Sartorius公司。
离心机(Thermo),真空抽干机(Eppendorf),高效液相色谱EASY-nLC1000(Thermo),QExactiveHF(Thermo)。
饲养110d后,取出实验组和对照组的小鼠,每一组选取体重差异较小的3只小鼠,采用断颈方式处死,获取小鼠的胃组织,并在PBS缓冲液中,剔除胃组织相连的脂肪、血管以及食管和十二指肠,按照胃的生理分区,把胃组织分为3个主要区域:前胃(Forestomach,F)、胃体(Corpus,C)和胃窦(Antrum,A)。使用PBS彻底清洗胃组织,去除胃组织中的残留食物,避免食物中的蛋白等物质对实验结果产生影响。
把分为前胃和胃体、胃窦的胃组织,每一区域取约10mg组织,加入含有1×蛋白酶抑制剂的8mol/L尿素裂解液中充分裂解,各组织分别取50μg蛋白进行还原烷基化,加入DTT至终浓度为1mmol/L,56℃金属浴30min,冷却至室温后,加入吲哚乙酸至终浓度为2mmol/L,避光反应30min,再次加入DTT至终浓度为1mmol/L,避光反应15min。把蛋白反应体系转移至FASP管中,离心使蛋白挂在FASP膜上,加入150mL50mmol/L的碳酸氢铵和1μg胰酶,37℃消化8–12h,得到的肽段真空抽干后–20℃保存。
将抽干的肽段分别溶解于30μL水溶液(5%甲醇,0.2%甲酸)中,16000×g离心10min,取1μL上清进行质谱检测。色谱分析柱:自制,填料为1.9μmC18,柱内径为150μm,长度30cm；流动相A为质谱水(含有0.2%甲酸),流动相B乙腈(含有0.2%甲酸)。150min检测梯度,B相浓度由5%逐渐升至40%。使用电喷雾离子源,电压为2.0kV,采用正离子采集模式,一级和二级采集质量范围分别是3001400m/z,流速为600nL/min。
搜索软件:Firmiana；搜索引擎:MASCOT；数据库:NCBI_MusmusculusRef-seq(34361种蛋白质,2013年7月更新)。一级误差:20ppm(partspermillion),二级误差:0.05Da。蛋白的假阳性率为1%的严格卡值。