导语：如何才能写好一篇流式细胞仪，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。
流式细胞术（FlowCytometry，FCM）是一门综合了激光技术、计算机技术、半导体技术、流体力学、细胞化学等多种学科知识的自动分析技术[1]，即利用流式细胞仪结合定量荧光细胞化学方法、单克隆抗体和免疫荧光染色原理和技术，对处在快速直线流动状态中的生物颗粒，比如各种细胞、微生物及人工合成微球等的多种参数（包括细胞大小、内部结构、DNA和RNA含量、细胞表面或胞内蛋白质分子的表达等）进行测量和分析，是当代最先进的细胞定性、定量分析以及细胞分选技术。近年来，随着流式细胞术的不断发展和完善，其应用领域已经从最初的细胞生物学基础研究扩大到现如今的肿瘤学、血液学、免疫学、药物学、临床检验等各个方面[1]。本研究以某医学院校科研平台流式细胞仪为分析对象，对其近3年来学生（包括本科生和研究生）使用人次和测试样品数加以统计，分析其使用现状，并对现存问题提出建议。
1流式细胞仪使用现状
学校科研平台于2013年购入一台BD公司的FACSVerse型流式细胞仪，是一台分析型流式细胞仪，蓝、红、紫三激光配置，配套BDFACSuite软件系统。对2017—2019年该台流式细胞仪的学生使用人次和测试样品数进行统计，如表1—2所示。从表1中可以看出2017—2019年学生使用流式细胞仪的人次和测试样品数逐年升高，从表2中可以看出使用人次增长率从2018年的67.74%提高到2019年的107.69%，测试样品数增长率从2018年的81.48%提高到2019年的137.87%，增幅明显。这些数据说明近年来流式细胞仪的利用率明显提高，越来越多的学生（包括本科生和研究生）能够学习、了解流式细胞术，并在日常科研活动中使用流式细胞仪，有效促进了学校的人才培养。
2使用现状分析
3结语
[参考文献]
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【关键词】儿童；B淋巴细胞性白血病；免疫分型；流式细胞仪
ImmunophenotypeofacuteB-lineagelymphoblasticleukemiainchildrenbyflowcytometry
WANGYi-lin,SUNLi-rong.TheMedicalShchoolHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266003,China
【Keywords】Children；B-lineageLeukemia；Immunophenotype；Flowcytometry
白血病免疫分型是对形态学分型的重要补充和进一步深化，随着儿童急性白血病治疗的进展，其免疫分型越来越受到重视，国际白血病MIC分型协作组认为免疫分型对每一例急性白血病都是必不可少的。为了发现儿童急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）免疫表型的特点及与预后的关系，我们利用流式细胞仪对39例急性B淋巴细胞白血病患儿的免疫表型进行分析，并对其治疗结果动态随访。现报告如下。
1材料和方法
1．2主要设备与试剂流式细胞仪为美国BeckmanCoulter公司生产，仪器型号：EPICS-XL。所有单克隆抗体（McAb）均购自法国Immunotech公司。
1．3检测方法采用直接免疫荧光标记法，每种单抗20μl，各加入100μl肝素抗凝的骨髓，室温避光，溶解红细胞，PBS洗涤，离心，加入500μlPBS，上机检测。采用CD45-SSC设门，用Elite4．5软件进行分析，同时以异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白荧光素（PE）、多甲藻素叶绿蛋白（PerCP）荧光素标记的无关同型IgG1亚类作为阴性对照。不同的抗体组合及不同的患者标本都用同一设定的条件检测，收集每管中的全部细胞。
1．4资料分析所有样本均在EPICS-XL流式细胞仪上检测，CD45-SSC设门将被检测细胞群分为4个区域：R1(淋巴细胞门)、R2(原始细胞门)、R3(成熟粒细胞门)、R4(单核细胞、巨核细胞门)，使用Elite4．5软件对R2门内的细胞进行分析，同时在CD19、CD10、CD20和CD22中选择两个单克隆抗体（McAb）组合，进行三色组合分析，确定免疫表型，≥20％为阳性。
1．5统计学处理方法χ2检验精确概率法。
2结果
2．1各种单克隆抗体阳性发生率39例急性B-ALL患儿中，CD19、CD22、CD10的阳性率都超过或接近90%，说明此3种McAb是B-ALL患儿最普遍的表达标志。同时有33．33%的患儿检测到髓系抗原（My）标志，其中以CD+138例，CD+335例。见表1。
2．2复发病例共有6例患儿复发，其中有3例患儿伴有髓系表达，见表2。经χ2精确概率法检验分析，P>0．05。说明B-ALL患儿是否伴有髓系表达与复发无关。见表2。
3讨论
近年来,随着FCM技术的不断发展以及大量细胞表面分化抗原和胞浆内抗原单克隆抗体(MaAb)的研制成功,用FCM进行免疫表型分析已成为鉴别正常细胞和白血病细胞的重要手段[1]。
CD45为白细胞共同抗原，在细胞表面的表达量与细胞分化程度有关。原始细胞表达量比成熟细胞低，幼红细胞不表达。用两个系列或分化阶段特异性McAb加CD45进行三色免疫荧光染色后，根据细胞的颗粒性与CD45表达量的不同，用SSC/CD45双参数设门，十分容易鉴别骨髓和血液中的原始或成熟细胞，可特异地分析原、幼白血病细胞的免疫表型而不受成熟细胞的干扰，大大增强了白血病免疫分型的准确度与灵敏度[2]。
研究表明,细胞表面所表达的抗原表明该细胞处在不同的分化过程中的特殊阶段[3]。正常B淋巴细胞分化过程中细胞表面分子出现的先后顺序大致为CD19、CD10、CD22、CD20、Cμ、SmIg,依此可判断B系ALL的分化阶段。B-ALL细胞发育与正常B细胞基本相似[4,5]。我们采用从原B细胞至成熟B细胞出现频率高有一定代表性的CD10、CD19、CD20、CD22和HLA-DR等作为常规表型检测，对其结果进行分析，可基本确定被测B细胞所处的发育阶段。
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【关键词】流式细胞术；临床；进展
流式细胞术(flowcytometry,FCM)是20世纪70年展起来的对单细胞定量分析的一种新技术。它借鉴了荧光标记技术、激光技术、单抗技术和计算机技术,具有极高的检测速度与统计精确性,而且从单一细胞可以测得多个参数,为生物医学与临床检验提供了全新视角和强有力手段[1]。目前,随着单克隆抗体技术的发展,流式细胞仪检测技术已经广泛使用在基础研究和临床实践的各个方面,发挥着重要作用。本文就其在临床上的应用综述如下。
1流式细胞术在免疫学中的应用
2流式细胞术在血液学中的应用
3流式细胞术在肿瘤学中的应用
FCM在肿瘤学中的应用主要是利用DNA含量测定进行包括癌前病变及早期癌变的检出、化疗指导以及预后评估等工作,FCM可精确定量DNA含量,能对癌前病变的性质和发展趋势做出判断,有助于癌变的早期诊断[6]。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液,用荧光染料(碘化吡啶P1)染色后对细胞的DNA含量进行分析,将不易区分的群体细胞分成三个亚群(G期、S期、G2期),DNA含量直接代表细胞的倍体状态,非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。DNA非整倍体细胞峰存在可为肿瘤诊断提供有力依据[6]。肿瘤细胞DNA倍体分析对患者预后的判断亦有重要作用。异倍体肿瘤恶性病变的复发率、转移率及死亡率均较高,而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。FCM不仅可以对恶性肿瘤DNA含量进行分析,还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效,了解细胞动力学变化,对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况,依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论,设计最佳治疗方案。从DNA直方图直接地看到肿瘤细胞的杀伤变化,及时选用有效的药物对肿瘤细胞达到最大的杀伤效果。
4流式细胞术在细胞凋亡和多药耐药基因中的应用
5流式细胞术在器官移植中的应用
FCM在器官移植中占有重要地位,可被用来判断供者与受者之间是否合适,用来鉴别和定型同种异体反应抗体[6]。通过供者白细胞和受者的血清共同孵育,如果受者血清中存在针对供者的循环抗体,就会同供者的淋巴细胞结合,再加入荧光素标记的二抗来显示这种结合,此方法能在移植手术前发现高风险的受体。移植后免疫表型的监测也很重要。FCM可用于检测移植后血液或移植内免疫成分的变化,以预防移植后免疫
排斥反应,细胞免疫抑制治疗效果和移植存活情况,可敏感地预测排斥反应的发生,为临床治疗提供有效依据。
6流式细胞术在临床细菌学中的应用
流式细胞术在临床细菌学中的应用具有快捷、灵敏,能同时进行多参数分析等优点,可广泛用于细菌、病原体、毒素和血清抗体及药敏试验。免疫荧光检测方法中的流式微球分析(CBA)是FCM的一个新应用。这种方法也可用于真菌、寄生虫、病毒以及这些病原体的混合感染的检测。近年来,FCM与荧光染料的联合运用可判断细菌的活力和功能状态,由于速度快,该方法已被建议作为临床实验室的常规药敏试验。FCM药敏检测方法较多,通过测量加入药物孵育后的散射光的DNA含量来判断抗生素对细菌的敏感性。该法现被认为是FCM在该领域应用的经典方法[6]。
7FCM在细胞生物学中的应用
在细胞周期内,DNA含量随时相发生周期性的变化,通过荧光探针对细胞进行相对DNA含量测定,可分析细胞周期各时相细胞的百分比,周期动力学参数以及DNA异倍体。可利用与钙离子特异结合的荧光染料和激发光谱或发射光谱是pH值依赖荧光染料进行细胞内钙离子浓度测定和细胞内pH值测定[9]。
8流式细胞术在优生遗传领域中的应用
流式细胞术可使含量极微的胎儿有核红细胞得到富集,因为有核红细胞含有胎儿的全部基因,并具有不影响多胎妊娠等优点,结合FISH,PCR等技术,使之具有应用于无创性产前诊断的广阔前景[10]。
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[关键词]流式细胞术；细胞形态学；脑脊液；中枢神经系统白血病
[Abstract]ObjectiveToevaluatethevalueofflowcytometricofcerebrospinalfluidcellsinthediagnosisofcentralnervoussystemleukemiainchildren.MethodsUsedDoubleimmunofluorescencestainingwithmonoclonalantibodies，45cerebrospinalfluidsampleswhohadcentralnervoussysteminvolvementwasanalyzedwithflowcytometricimmunophenotypingandconventionalcytologyinJanuary2015toMarch2016，theresultsofflowcytometrywerecomparedwithconventionalcytology.ResultsTheresultsshowedthat33.33%childrenhadabnormalcellsbyflowcytometryand20%childrenhadabnormalcellsbyconventionalcellmorphologyin45cases。Thedifferencehadstatisticalsignificance（P<0.01）.ConclusionFlowcytometriyanalysisofcerebrospinalfluidhasimportantclinicalsignificanceinthediagnosisofCNSLinchildren。
[Keywords]Flowcytometry；Conventionalcytology；Cerebrospinalfluid；Immunophenotyping；Centralnervoussystemleukemia
随着化疗方案的改进，我国儿童急性淋巴细胞白血病（acutelymphoblasticleukemia，ALL）的疗效获得了显著改善，儿童ALL诱导缓解率高达91%～94%，5年无事件生存（EFS）率达70%～80%[1-3]。中枢神经系统白血病（CentralNervousSystemLeukemia，CNSL）是导致白血病化疗失败的主要原因之一，如何早期诊断CNSL具有重要意义。该文将对2015年1月―2016年3月期间45例急性淋巴细胞白血病（AcuteLymphoblasticLeukemia，ALL）的脑脊液进行分析，以研究脑脊液FCM在CNSL诊断中的意义，现报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料
根据2014年制定的儿童ALL诊疗建议（第四次修订）为诊断标准[4]，以明确诊断急性淋巴细胞性白血病的患儿为对象，方便选取该院收治的临床疑似中枢神经系统浸润45例进行脑脊液CC及FCM检测。符合以下任何一项，并除外其他原因导致的枢神经系统病变时，列为可疑中枢神经系统浸润病例：①有神经系统症状；②脑脊液常规白细胞计数大于5×106个/L时；③头颅核磁或CT提示影像学病变。
1.2脑脊液细胞常规计数
将留取无菌新鲜脑脊液标本2mL充入细胞计数板，高倍镜下计数有核细胞数。
1.3脑脊液细胞学检查
吸取2～3mL脑脊液，标本离心后涂片，干燥后进行瑞氏染色，显微镜下观察细胞形态，发现原始幼稚细胞则判定结果阳性。
1.4FCM分析
采用单克隆抗体双重直接免疫荧光素（FITC/PE）标记法。留取2～3mL新鲜脑脊液于无菌试管中，离心（1400r/min，5min）后弃上清，留取100μL，加入相应抗体，充分混匀，在室温、避光条件下孵育15min，加入1mL溶血素1mL，混匀后避光，室温放置8min，离心（1400r/min，5min）弃上清，用PBS洗涤细胞，离心（1400r/min，5min）后，弃上清，加入约3mLPBS洗涤细胞，离心后弃上清，加入约100μLPBS后，震荡混匀，立即上机检测。流式细胞仪及所有抗体来自美国BD公司。含六种荧光抗体标记：FICT、PE、APC、PerCP、APC-Cy7、PE-Cy7。
1.6统计方法
采用SPSS17.0统计学软件进行数据分析。计数资料以例数表示，采用χ2检验，P
2.145例儿童ALL的临床特点
可疑中枢神经系统浸润者45例，所有病例均进行FCM及CC检测，其中男性28例，女性17例，年龄1～18岁，平均年龄（9.09±5.41）岁，其中B系20例，T系25例。45例病例中3例患儿有头痛、呕吐表现，44例患儿脑脊液常规白细胞计数≥5×106个/L，未发现头颅核磁及CT的影像学改变。两组检测方法在年龄、性别、免疫型、白细胞计数及神经系统症状方面，差异无统计学意义。见表1。
2.2FCM与CC两种方法对45例ALL脑脊液异常细胞的检测结果
45例怀疑中枢神经系统侵润者的脑脊液细胞，其中FCM有15例发现异常免疫表型，其中B系6例，T系9例，阳性率为33.33%，CC发现9例存在原始幼稚细胞，其中B系3例，T系6例，阳性率为20%，两者检测方法的差异具有统计学意义（P
儿童CNSL发病率在2%～10%之间[5]，目前CNSL诊断金标准仍是脑脊液细胞形态学发现异常幼稚细胞，但脑脊液标本细胞数量少，离体环境下容易发生自溶，受主观经验性判断影响大，容易出现CNSL的误诊及漏诊，假阴性率高达20%～60%[6]，单纯依靠脑脊液细胞学检查并不能完全排除CNSL的诊断。FCM的细胞免疫分型是检测微量异常细胞非常敏感的方法，通过细胞表面标记片段确定各细胞群性质，受细胞形态变化影响小，亦不易受主观影响，能够准确的检测恶性肿瘤细胞，已广泛用于脑脊液检查中。
早期CNSL可无临床表现、影像学阳性发现，甚至脑脊液常规检查也无细胞数增高。蒋能刚等[7]报道，多参数FCM分析在细胞数量较少情况下，显示出明显优越性。该次130例脑脊液中，发现1例细胞数为4×106个/L的ALL（T系），CC-FCM+发现异常细胞群，异常细胞群占总细胞的54.14%，表达CD5。在45例怀疑CNSL的脑脊液中，15例诊断CNSL的病例中白细胞数在4～100×106个/L之间有6例，其中FCM+有4例，CC+有2例。脑脊液白细胞计数越高，形态学及FCM越容易发现异常细胞，其中细胞形态学更为明显。而脑脊液白细胞数少时，FCM相较于CC更敏感。此外，有报道指出[8]，当行FCM及CC检测时，CC容易受到FCM结果影响。该次研究也存在类似问题，有2例脑脊液发现FCM阳性结果后，CC更改了起初阴性结果的判读，可见，细胞形态学分析对于良恶性细胞的判断主观性仍较强。
脑脊液FCM在CNSL诊断中，具有很高的灵敏度和特异性。MitriZ等[8]报道，脑脊液流式细胞术和CC的特异性均为100%，但前者的敏感性明显高于CC，接近100%。RantaS等[9-11]研究显示，在高度怀疑中枢神经系统侵润的淋巴瘤中，FCM的CNSL检出率是细胞形态学的2～3倍。该研究对70例ALL患儿，共130例次脑脊液标本进行FCM及CC检测，其中45例怀疑有CNSL可能，CC阳性检出率为20%（9/45），FCM的阳性检出率为33.33%（15/45），是CC检出率的1.67倍，与报道类似。建议对怀疑有中枢神经系统病变的患者，在进行脑脊液细胞形态学检测的同时，进行FCM的评估，以提高早期诊断CNSL的阳性率。
综上所述，脑脊液FCM的阳性检出率及准确性明显高于传统脑脊液CC方法，对CNSL的诊断具有极大的应用价值，是诊断CNSL方法的重要补充。由于CNSL发病率较低，对于FCM及CC诊断的一致性仍需要今后大样本进一步研究论证。
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[关键词]脐血干细胞；类风湿关节炎；IL-1β；TNF-α；IL-4；IL-10
类风湿关节炎（rheumatoidarthritis，RA）是一种以关节滑膜及周围结缔组织异常增生、关节进行性破坏为特征的慢性自身免疫性疾病[1]。传统的治疗药物，如免疫抑制剂、糖皮质激素、生物制剂等，虽能使部分患者的病情活动得以控制，但长期应用副作用较大[2]。间充质干细胞因具有免疫调节作用[3]，为RA治疗带来新的希望。本研究尝试采用hUCBSCs穴位移植方法治疗类风湿关节炎大鼠模型（CIA），观察对白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-4（IL-4）、白介素-10（IL-10）的影响，探讨hUCBSCs穴位移植治疗RA的作用机制。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验材料
牛Ⅱ型胶原（C7809，5mg，Sigma公司）；弗氏完全佐剂（098K8729-CAS9007-81-2，10mL，Sigma公司）；流式细胞仪抗体PE-CD34。甲氨喋呤（MTX），上海医药集团有限公司信通制药厂，产品批号002091。
1.1.2实验动物
近交系雌性Wistar大鼠120只，动物年龄45～50d，体重（180±20）g，由辽宁中医药大学实验动物中心提供。
1.1.3脐血
选择辽宁中医药大学附属医院（以下简称“我院”）妇产科排除了HIV、HBV、HCV、CMV、EBV、梅毒等急、慢性感染，无血液系统疾患及其他系统疾病的非高危妊娠健康足月产妇，新生儿为经阴道顺产且生后皮肤红润，四肢活动良好，无感染征象的脐血。本研究经我院伦理委员会通过，所有产妇及家属知情同意，并签署知情同意书。
1.2实验方法
1.2.1脐血干细胞分离
将采集到的新鲜脐血用HES沉淀法分离脐血单个核细胞，制成MNC悬液，用台盼蓝拒染色试验测细胞存活率，若细胞存活率>95%，则进行下一步实验。用MiniMACS磁性吸附性分离装置，进行CD34+细胞的分离与纯化，用台盼蓝拒染色试验测细胞存活率，流式细胞仪测定CD34+细胞百分比[4]。将处理完毕的采集物低温冻存以备回输。
1.2.2分组、造模与给药
1.2.2.1实验分组将近交系Wistar大鼠120只随机分为六组：正常对照组（A组）、模型组（B组）、hUCBSCs腕关节注射治疗组（C组）、hUCBSCs尾静脉注射治疗组（D组）、hUCBSCs外关穴注射治疗组（E组）、MTX灌胃治疗组（F组），每组20只。
1.2.2.2建立CIA动物模型实验模型采用邓安梅法[5]。除A组外，寒冷刺激10d后，将10mg牛Ⅱ型胶原（BⅡC）与5mL完全氟氏佐剂研磨后，以每只100μL于大鼠背部、踝部、尾根部皮内注射免疫，免疫注射20d后，于第21天按上述方法20μL再次腹腔内注射，作为激发注射免疫。A组在寒冷刺激10d后，按上述方法及相同部位注射等量的注射用水。
1.2.2.3hUCBSCs输注途径及剂量CIA大鼠免疫接种后第31天（除A组及B组用蒸馏水），开始hUCBSCs移植治疗。C、D、E组分别向腕关节腔、尾静脉、外关穴注射0.5mL0.9%氯化钠溶液和0.5mLhUCBSCs悬液（含干细胞2×107/mL），F组MTX灌胃治疗（MTX研成细末，加生理盐水配成悬浊液灌胃0.0175g/kg），每周1次。
1.2.2.4指标检测在hUCBSCs输注4周后ELISA法测定CIA大鼠外周血细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10的含量。
1.3统计学方法
采用SPSS15.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，采用t检验或方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1A、B两组大鼠血清中各指标比较
由于实验操作等原因，在实验过程中有3只死亡，其中B组死亡2只，F组死亡1只。B组大鼠血清细胞因子IL-1β、TNF-α明显高于A组，而IL-4、IL-10明显低于A组（P<0.05）。见表1。
表1A、B两组大鼠血清中各指标比较（μg/L，x±s）
注：与A组比较，P<0.05；IL-1β：白介素-1β；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-4：白介素-4；IL-10：白介素-10
2.2B组与各治疗组各项指标的比较
与B组比较，各个治疗组IL-1β、TNF-α明显降低，IL-4、IL-10明显升高（P<0.05）。与F组比较，C、D组IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10无明显变化（P>0.05）。与F组比较，E组IL-1β、TNF-α明显降低，IL-4、IL-10明显升高（P<0.05）。见表2。
表2B组与各治疗组各项指标的比较（μg/L，x±s）
注：与B组比较，*P<0.05；与F组比较，#P<0.05；IL-1β：白介素-1β；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-4：白介素-4；IL-10：白介素-10
穴位注射是在中医理论的指导下，通过针刺与药物注射相结合的一种注射方法[11-12]。针刺腧穴达到疏通经气、调节脏腑气血功能，同时又与药物相结合发挥药物治疗作用，从而达到腧穴、针刺、药物三者相结合的治疗效果。药物注入穴位后激发了腧穴的良性调整作用，具有吸收快和放大药物治疗作用的效应。这样就可以减少药物的用量，提高疗效。外关穴为手少阳三焦经之络穴，是八脉交会穴，通阳维脉[13]。外关穴注射异基因hUCBSCs治疗RA，一方面具有针刺效应，调节阴阳，刺激神经-内分泌-免疫网络，调节紊乱的免疫功能，另一方面发挥异基因hUCBSCs的作用，调节RA患者机体免疫紊乱，阻止病情进展。
本实验研究hUCBSCs穴位移植治疗CIA大鼠，在实验中采用外关穴注射、腕关节腔注射及尾静脉注射三种方法，结果显示，三种治疗方法对RA大鼠均有明显的治疗作用，外关穴位移植对RA大鼠细胞因子的影响更大，作用明显优于MTX。这可能与穴位的作用不可分离[14-15]。异基因脐血干细胞外关穴位移植治疗的特点就是调整机体的免疫功能，表现在能恢复和促进IL-4、IL-10含量使Th2升高，降低TNF-α、IL-1β的量使Th1降低，使失衡的Th1/Th2趋向平衡，可能是通过抑制炎症细胞迁移、抑制内皮细胞黏附分子的表达、抑制滑膜细胞过度分泌细胞因子及炎症介质[16-17]，从而减轻了临床症状，延缓了病理进展，防止了关节畸变和功能破坏。
综上所述，本项目是将传统医学的穴位疗法与现代医学的干细胞移植技术相结合，以期开辟一条新的移植途径，可以使干细胞更为简单、无创、准确地运送到目的地，探求对RA新的治疗方法，并通过此进一步分析RA的发病机制。
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山东省济南市济阳县人民医院，山东济南251400
[摘要]流式细胞仪被广泛的应用于光学、生物学、流体学和免疫学等领域。其中流式细胞术是其检测的关键性技术，具有灵敏、快速的特点，在细菌的快速检测中得到较为广阔的应用。本文就流式细胞术在环境样品细菌检测、临床细菌检测和趋磁细菌研究中的应用前景进行分析，以促进流式细胞技术的发展和完善。
[
关键词]流式细胞术;细菌;快速检测;应用
流式细胞术于90年代末期被创建，最初仅用于临床检验和科学研究，由于微生物的粒子或细胞较小，因此在微生物领域应用的较晚。但在近几年来，随着荧光染料的改良和丰富、光学科技的不断完善，以及流式细胞检测仪自身的不断发展进步。在如今，流式细胞术在微生物领域得到较为广泛的应用，尤其是对于细菌学问题的解决具有多参数测量精确，并且迅速的特点。
1流式细胞术在环境样品细菌检测中的应用
以往对环境样品通常应用的方法为平板法，对微生物的多样性和总菌数的深入研究具有严重的制约性，常会给检测结果带来较大的误差，并且其他传统的检测方法，具有操作复杂繁琐的特点。但流式细胞是在环境样品中的推广应用，具有测定精准、制备简单、可快速的对多参数数据进行采集，以及可对多元数据进行分析。如今，流式细胞术已广泛的应用于土壤、水和空气等环境中的微生物研究的重要工具，图1为流式细胞术的样品制备技术。
曾有学者应用荧光原位杂交技术结合流式细胞检测仪对猪谷仓空气和实验室空气中的微生物进行测定。先用液化收集器获取样品，然后用荧光染料染色后，应用流式细胞术辨别样品粉尘杂质中的菌体，并且可通过计数处理，获取细菌总数。流式细胞术还可用以土壤样品的检测，JeanChristophe等学者应用流式细胞术对土壤样品中的微生物进行定量和定性检测。应用溴化乙锭和跟16SrRNA具有互补作用的荧光探针结合光散射参数对菌体的大小进行限定，然后从土壤微生物的粉尘碎片和群落中区分出絮凝剂产生菌检测菌[1]。
另外，还有学者应用该术对水环境进行细胞的快速检测,采用流式细胞术和FISH对新加坡压舱水的肠道菌数、弧菌数、细菌总数和大肠杆菌属进行检测。经检测结果发现，应用不同取样点的压舱水，其检测结果会存在较大的差异，该种现象说明航运业的压舱水的水质情况较为复杂，并且受到多种因素的制约和影响。这些检测实验表明，应用流式细胞术能够进行水质检测和污染监测，在工业不断发展的今天，对于生态文明建设，该监测方法的应用具有极为重大的意义。
2流式细胞术在临床细菌检测中的应用
流式细胞术在最初主要应用为哺乳类动物的检测，在临床上的应用极为少见。但目前在临床中，已得到广泛的应用，并且样品的检测范围也从最初的的真核细胞检测扩展到原核生物的细胞检测中，甚至可对更小的病毒进行检测。具有快速、灵敏的特点，对促进病症的及时确诊具有重要的作用。较为常用，并且效果最佳的是对于菌血症的诊断。在临床检查中，异质性和药敏性极为常见，并且两者间具有紧密的联系，流式细胞术在临床细菌检测中的应用，最初始于对药敏性的检测。
流式细胞术在临床医学中的应用，还可应用于其他病菌的检测。有学者曾应用结合分支杆菌采用荧光素SYBRGreenI和二氧化硅纳米颗粒两种燃料标记后，结合流式细胞术进行检测。其检测的菌浓度可低至3.5×103~3.0×104个/mL，相对于单纯使用FITC染色的流式细胞术应用更为明显[3]。此外，据有关实验表明，流式细胞术的临床细菌诊断，并不仅仅是局限于普通的细菌检测，还可用于休眠体的检测，能够在其活化前，对疾病作出诊断，进行尽早的诊断，对于患者的康复具有重要作用。
3流式细胞术在趋磁细菌研究中的应用前景
结合流式细胞仪的应用原理，以及检测微粒时可应用荧光染料标记定量测量的特点，初步推断流式细胞术能够应用于检测趋磁细菌磁小体合成量。因为趋磁细菌结合体的体内合成磁体较小，并且数量不相等，致使胞内粒度的大小直接受到磁小体多寡的影响。根据流式细胞术侧向散射光信息能够表示细胞胞内粒度的具体情况,因此，流式细胞术在未来的发展研究中，应能够用于趋磁细菌磁小体量的检测，但在目前仍未找合适的磁小体荧光探针，所以还有待于进一步的深入研究。此外，流式细胞术还可以应用于趋磁细菌非趋磁标准珠和突变株的检测研究，据有关研究观察发现趋磁细菌的非区磁性的突变体能够自发的形成[5]。但在目前的研究中，流式细胞仪应用于趋磁细菌还存在一定的局限性，需要对其仪器精度的提升深入研究，方能进一步的促进流式细胞术在趋磁细菌中的应用。
4结语
流式细胞术在微生物领域中的应用较广，只要可进行荧光分子标记的微粒和细胞，均可应用流式细胞仪检测。尤其是用以形体较为微小的粒子，具有灵敏度高、迅捷、逐个检测、多参数分析等优点。但由于其前期的应用成本较高，并且在样品处理和荧光染料的选择方面仍然存在一定的局限性，还需进一步的研究。但在现代科技不断进步发展下，流式细胞术会有更为广阔的应用前景。
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作者：韩兆东阮月芹安新业孔祥华陈佳荣周玉明
【关键词】细胞
【关键词】流式细胞仪；临床应用；流式细胞术
流式细胞术（flowcytometry，FCM）是利用流式细胞仪对细胞等生物粒子的理、化及生物特性进行分析的方法。流式细胞仪是近代细胞生物学、分子生物学、分子免疫学和单克隆技术、激光技术、电子计算机术等学科高度发展的综合结晶。在免疫学、血液学、肿瘤学等学科及临床研究方面得到广泛应用［1］。
FCM的应用标志着细胞学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞的分子水平的研究，随着对FCM研究的日益深入，其价值已经从科学研究走入了临床应用阶段，在我国临床医学领域里已有着广泛的应用。
1FCM在免疫学中的应用
2FCM在血液学中的应用
白血病分型是MIC分型的重要组成部分，也是对FAB分型的补充；是对白血病诊断、选择化疗方案和判断预后的重要依据；对白血病发病机制的研究也具有重要作用。由于白血病不同系列、不同分化阶段血细胞膜表面及浆内表达不同的分化抗原，且与相应正常骨髓细胞的表达存在差异，故应用FCM能很好的对白血病进行免疫分型，并能够提供正常细胞在演变成恶性肿瘤过程中细胞基因及抗原标志发生变化的信息，而这种变化常常是细微的，以至于常规FAB方法不能分辨。这使我们对血液肿瘤细胞的生物学特征有了更深入和更精确的认识。FCM还可用于血小板膜糖蛋白异常所致疾病的诊断，包括先天性或获得性血小板的疾病，评价活化血小板程度在血栓疾病和血栓前状态发生发展中的作用。用FCM通过对外周血网织血小板的测定，有助于血小板减少症的病因学诊断。可作为骨髓移植、造血促进因子和骨髓移植后骨髓血小板造血恢复有用的监控指标。
应用FCM检测某些免疫指标，能对再生障碍性贫血的发病机制进行研究。再障是一组由不同发病机制介导的骨髓造血功能障碍综合征。其发病机制复杂，目前尚未完全明了，但越来越多的临床和实验室证据表明免疫介导的造血抑制，是再生障碍性贫血最常见的病理之一。而且，具有免疫表型异常（如CD4/CD8倒置、CD8+活化T细胞或TCRγ，δ等异常增高）的患者临床表现相对严重，但免疫治疗相对有较好的疗效。
微小残留病灶（MRD）检查：白血病病人在获得血液学缓解后，体内还存在1010以下的白血病细胞。这样少量的白血病细胞常规的显微镜不能检出。在强化治疗和维持治疗后可逐步减少，但难以彻底清除，这是复发的根源。检测MRD是决定进一步治疗策略和选择采集外周血造血干/祖细胞自体移植及异基因骨髓移植时机的依据。
多发性骨髓瘤（MM）：多发性骨髓瘤是浆细胞异常增生性疾病，正常浆细胞为CD38+/CD45dim-，使用CD38/CD45双标记检测外周血和骨髓标本，可以准确划定浆细胞群。通常使用CD38和CD45，结合轻链检查，对多发性骨髓瘤细胞进行分析。另外，正常浆细胞的表面标记为CD19+/CD56-，而多发性骨髓瘤细胞通过为CD19-/CD56+。这样，使用流式细胞仪对外周血或骨髓标本进行多参数分析，并计算浆细胞含量，对于多发性骨髓瘤的诊断和治疗评估有重要意义。
3FCM在肿瘤学中的应用
多药耐药（MDR）的研究：白血病治疗及肿瘤化疗的失败在很大程度上是由于白血病细胞及肿瘤细胞对化疗药物产生了耐药。因此，对白血病和肿瘤细胞耐药机制的研究具有重要的意义。但耐药的形成过程很多，主要有几个方面，包括药物吸收减少、细胞解毒作用增强、靶分子改变、DNA损伤修复能力增强、细胞内药物溢出增多、细胞凋亡的抑制等。多药耐药基因编码的P糖蛋白，是白血病细胞及肿瘤细胞抗药性的分子学基础，也是影响化疗疗效的主要障碍。利用FCM检测多药耐药基因，则可为药理学研究提供依据。
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关键词：IPS细胞；分化；造血干细胞
0引言
小鼠骨髓基质细胞OP9购于美国ATCC，诱导性多能干细胞IPS由中科院广州生物医药与健康研究院提供。
1.2试剂和仪器
小鼠骨髓基质细胞OP9的培养基为α-MEM，内含20%的胎牛血清，OP9细胞诱导干细胞分化培养基为α-MEM（15%的DFBS、0.25%胰酶、0.1%明胶），CD34来自MACS公司。抗体为APS-TRA-1-85，半固体培养基购于SCT公司。流式细胞仪为美国AccuriC6型，定量PCR仪为CFX96型。
1.3方法
在六孔板中先铺好1%的metrigel进行细胞培养，每三天添加0.5mmol/L的EDTA，以保持对照组细胞的未分化状态，OP9用细胞培养液培养，培养时放在大小为10cm且铺有0.1%的明胶的盘里，，每隔四天用胰酶消化传代。细胞培养温度为37℃，CO2浓度为0.5，湿度饱和。
OP9细胞进行传代培养4天后，将OP9的培养液换成诱导干细胞分化的培养液，将UC013细胞洗两遍后，再对边缘部位细胞进行消化，将细胞吸出后加入Dispace，再用枪头吹吸混匀细胞后，将其转移到加有分化培养液的细胞盘中摇匀，在与上述培养的温度、空气CO2浓度和湿度相同的条件下进行培养，培养的第二天将培养液换为共培养液，第四天开始每隔一天半换一次培养液，第九天收样品。
免疫磁珠法分选CD34+细胞，将细胞用PBS洗两遍，接着用胰蛋白酶进行消化，制备单细胞悬液，再将细胞收集到离心管中进行离心，收集沉淀，再向其中加入2%血清吹打均匀。过滤后，向其中加入FCR和CD34标记细胞，30秒后加入流式细胞缓冲液，再离心，然后吸取上清，加入流式细胞缓冲液重悬。将制备好的细胞悬液加入流式细胞仪进行分离，通过流式细胞仪分离柱的CD34-细胞被移出分离柱弃之，最终，通过加压洗脱分离柱上黏附的细胞，即得到CD34+细胞。
用流式细胞术进行检测，将共培养9天后的细胞用PBS清洗、胰蛋白酶消化后，制备单细胞悬液，收集到离心管中，静置五秒后，用加有2%血清的流式缓冲液重悬，细胞过滤后，加入FCR和抗体，孵育15min，再用流式缓冲液清洗，重悬，最后用流式细胞仪进行检测。
集落形成实验。将分选的CD34+细胞接种到半固体培养基中，放于培养皿中进行培养，每孔接种1万个细胞，培养14-16天。然后，在显微镜下根据集落成的血细胞形成特征，对集落细胞进行分类和计数。同时，提取共培养2、4、6、8、10和12天的细胞的RNA，用RT-PCR法检测各基因在细胞中的相对表达量。
2.1细胞培养与观察
观察培养的细胞，结果显示，对照组未分化的人体细胞集落状生长，呈扁平状，排列紧密，没有分化的迹象。实验组培养2天后的细胞，表面布满细胞集落，已进行造血干细胞分化。OP9细胞贴着细胞壁生长，细胞为三角形，周围向外出伸出像纤维状的伪足，细胞排列规则，生长迅速，培养4天后细胞铺满了培养皿底。
2.2诱导造血干细胞分化
通过在本实验组的诱导分化条件下，对实验组和对照组细胞的培养，实验组细胞分化到一定程度后，便开始大量克隆，细胞的形态也发生了分化，接着，OP9细胞开始出现老化迹象。
2.3流式细胞术检测
共培养9天后用流式细胞仪检测细胞造血表面标志物表达情况，用流式细胞仪分析培养细胞的CD34、CD43、CD31的表达情况，结果显示表达上述表面标志物的细胞分别占有比例为20%、2%和7.1%。
2.44RT-PCR检测
运用RT-PCR对共培养的细胞进行基因表达检测，结果显示，IPS细胞发生造血分化时，Oct-4基因的表达慢慢消失；造血转录因子基因表达缓慢升高；Runx-1基因在造血干细胞分化12天当中的表达呈波浪式变化，其中分化第二天表达量最高，第四天开始下降，第八天开始升高；CD34在造血分化过程中的基因表达量逐渐增高。
2.5CD34+细胞集落实验
CD34+细胞在半固体培养基中进行培养，根据造血干细胞的形态特征，对细胞集落进行分类和计数。结果显示，红系集落（CFU-E）、粒系集落（CFU-G）、巨核系集落（CFU-M）、粒―巨核系集落（CFU-GM）集落数量持续升高，混合系集落（CFU-GEMM）的集落数量逐渐降至最低。
随着干细胞技术的发展，通过诱导分化得到造血干细胞已经成为事实。相对于多能干细胞而言，IPS通过导入转录因子以及重编程进行定向分化的比例较低，，但是IPS的获得方法比较简单稳定，避免了胚胎干细胞面临的伦理和法律等问题，使IPS可以应用于细胞替代性治疗，并可以进行疾病的机理研究和肿瘤治疗药物的筛选。IPS细胞分化得到的造血干细胞免疫原性较低，解决了移植排斥的问题。
在本文的研究中，没有外加细胞因子，直接将IPS细胞诱导分化为造血干细胞，结果获得了20%的CD34+细胞，即造血干细胞，CD34是表达于造血干细胞的表面标志物，表明IPS可以分化为造血干细胞，但是转化率比较低。Runx1是调控造血干细胞分化的转录因子，期基因的表达量在分化过程中呈现波浪式的变化，Gata-2的表达则逐渐升高。体外分化得到的造血干细胞在半固体培养基中成集落状态，说明IPS可以向各细胞系进行分化。
4小结
通过将IPS定向分化为造血干细胞的研究，成功诱导了造血干细胞，分化得到的细胞在体外培养中形成了所需的各系集落，本文的研究所采用的技术方法希望可以为IPS细胞在造血疾病中的应用提供一定的实验依据。
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关键词：槲皮素；抑制；膀胱癌
槲皮素(quercetin，Que)是一种天然的黄酮类化合物，广泛存在于多种植物中，尤以红麻叶和湖南连翘中含量较高，具有抗感染、抗过敏、清除氧自由基、降血脂等多种药理作用[1]。最近也发现其具有广泛的抗肿瘤的作用[2]。本实验主要探讨了槲皮素抑制人膀胱癌细胞增殖的作用机制。
1.2.1分组培养:将膀胱癌细胞株培养于RPMI-1640培养基中，在对数生长期时，收集细胞并调整细胞浓度为4×104个／ml，接种于96孔板，每孔加100μl细胞悬液。24h后，实验组分别加入终浓度分别为0、70、140、210μmol／L的槲皮素，另一孔只加培养液，作为空白对照，每组分别设5个复孔。
1.2.2活性检测:分别在24、48和72h后，加入20μl(5mg／ml)的MTT，4h后弃上清。再加入200μl的DMSO，用酶标仪(波长570nm)测定各孔吸光度(A值)，并计算细胞生长抑制率。
1.2.3细胞凋亡率检测:取对数期膀胱癌细胞，接种于6孔板，培养24h后，再加入槲皮素至终浓度70、140和210μmol／L，然后在流式细胞仪(FACS-Calibur)上进行细胞凋亡分析检测。
2实验结果
2.1形态观察:对照组膀胱癌细胞呈长梭形，边缘比较光滑整齐，核大。而经槲皮素处理的膀胱癌细胞开始变圆，核部分碎裂，并有部分细胞脱离培养板。
2.2细胞活性检测:与对照组相比，各浓度间的增殖抑制率差异显著（p
2.3流式细胞仪检测凋亡结果:分别是0、70μmol/L、140μmol/L和210μmol/L槲皮素浓度作用结果。槲皮素作用24h后凋亡率分别为0.58%、12.28%、15.14%和24.31%；作用48h后凋亡率分别为0.77%、14.15%、23.32%和37.39%；作用72h后凋亡率分别为14.24%、55.48%、57.81%和62.57%。
[1]NijveldtRJ，VanNoodE，VanHoornD，eta1．F1avonoids：areviewofprobablemechanismsofactionandpotentialsapplications[J]．AMJClinNutr，2001，74：418-425
【关键词】粉防己碱;卵巢癌;增殖;凋亡
1.1材料人卵巢癌细胞株HO-8910(中科院上海细胞所提供);粉防己碱(江西银涛药业有限公司),25℃溶于DMSO中;胰蛋白酶、RPMI-1640、吖啶橙、胎牛血清(华美生物公司);MTT及二甲亚砜DMSO(sigma公司)。
1.2方法
1.2.1细胞培养人卵巢癌HO-8910细胞株,培养基为RPMI-1640内含10%灭活胎牛血清、37℃、5%二氧化碳的饱和湿度培养传代。
1.2.2实验分组共分5组:实验组:加入粉防己碱,终浓度分别为1.0mg/L,5.0mg/L,10.0mg/L及20.0mg/L组;对照组:加入等量的RPMI-1640培养液(每组设6个复孔)。
1.3实验指标的检测
1.3.1MTT试验
取对数生长期的HO-8910细胞,制成浓度为1×105个/mL的单细胞悬液,接种于96孔培养板中,每孔200μL,过夜贴壁后;实验组加入1.0mg/L,5.0mg/L,10.0mg/L及20.0mg/L的粉防己碱,对照组加等量的RPMI-1640。每组设6个复孔,继续培养24、48h后加入MTT(5mg/mL)20μL/孔,4h后吸净上清液,加入DMSO20μL/孔,震荡10min,用酶标记光仪在波长为560nm时测定每孔的吸光度(A)值,计算不同浓度抗体对细胞增殖的抑制率[抑制率=(对照组A均值-实验组的A均值)/对照组A均值[1]]。
1.3.2AO染色
取对数生长期的HO-8910细胞,制成浓度为5×105个/mL的单细胞悬液,按上述粉防己碱浓度培养48h后,离心弃上清,用PBS洗3次,95%乙醇固定15~30min;1%醋酸酸化30s;加入0.01%AO染色1~5min,封片,镜下观察并摄影。
1.3.3流式细胞仪检测细胞周期
取对数生长期的HO-8910细胞,制成浓度为1×106个/mL的单细胞悬液,按上述浓度培养24h后,收集细胞,PBS洗涤,制成单细胞悬液,用70%的冰乙醇4℃固定12h,用含核糖核酸酶及碘化丙锭的染液染30min,上流式细胞仪进行检测。
1.3.4流式细胞仪检测细胞凋亡率
取对数生长期的HO-8910细胞,制成浓度为1×106个/mL的单细胞悬液,接种于6孔培养板中,按上述浓度培养24h后,收集细胞,用AnnexinV-FITC/PI双标记染色后做流式细胞仪双色分析。
1.4统计学处理
采用SPSS13.0统计软件进行统计分析,所有数据均用±s表示,统计方法采用方差分析,组间比较采用q检验。
2.1MTT试验结果
表1实验组和对照组卵巢癌细胞内的吸光度值和增殖抑制率(±s)组别粉防己碱
(mg/L)24h吸光度值(±s)抑制率(%)48h吸光度值(±s)抑制率(%)对照组00.605±0.00600.608±0.0050实验组10.562±0.004*7.110.535±0.003*12.0150.508±0.009*16.030.420±0.005*30.92100.450±0.008*25.620.325±0.003*46.55200.333±0.008*44.960.235±0.003*61.35
2.2AO染色
凋亡细胞体积明显缩小,核碎裂,核内可见浓缩边集的染色质,呈新月形或肾形致密浓染的黄绿色染色,荧光亢进(图1)。
2.3粉防己碱对卵巢癌细胞周期分布和凋亡率的影响
不同浓度粉防己碱作用卵巢癌细胞24h后,与对照组相比,细胞周期分布、凋亡率均发生改变,即G1/G0期细胞比例数上升,S期和G2/M期下降,细胞凋亡率上升,均有显着差异(P<0.05),且与粉防己碱浓度之间具有剂量依赖性(P<0.05,见表2)。
表2粉防己碱对卵巢癌细胞周期分布和凋亡率的影响(±s)注:采用方差分析*P<0.01
粉防己碱是一种具有广泛药理学作用的双苄基异喹啉类生物碱,是粉防己的主要有效成分。早期研究表明粉防己碱具有消炎、镇痛、降压、抗纤维化等广泛的药理作用。近年来的研究证实粉防己碱是天然的非选择性的钙通道阻滞剂,又是钙调蛋白的拮抗剂,具有直接抗肿瘤的作用。Kuo等[2]发现,粉防己碱不仅抑制人肝癌HepG2细胞株的生长,还可诱发凋亡。何琪扬[3]等采用台盼蓝计数法发现粉防己碱对敏感急性白血病细胞株HL260和抗三尖杉酯碱的HL-60细胞均有生长抑制作用。王瑞珍[4]等用粉防己碱处理人食管癌细胞,观察到肿瘤细胞分裂指数低于对照组约50%。DongY[5]等观察到粉防己碱可抑制HL260细胞生长,认为粉防己碱可通过诱导肿瘤细胞凋亡而抑制肿瘤细胞生长。