在使用HOECHST33258染色液时，通常的步骤包括细胞爬片或组织切片，用PBS清洗，加入染色液避光孵育，再次用PBS清洗，然后用防荧光淬灭封片剂封片，最后在荧光显微镜下观察或拍照。使用完毕后，染色液应存放在-20℃并避光保存。
1、对于固定的细胞或组织样品，首先进行适当洗涤以去除固定剂。如果需要进行免疫荧光染色，则先进行免疫荧光染色，染色完毕后再按后续步骤进行HOECHST33258染色。
2、在贴壁细胞或组织切片上，加入适量的HOECHST33258染色液。注意，该染色液是一种非嵌入性荧光染料，可以在活细胞或固定细胞的DNA聚AT序列富集区域的小沟处与DNA结合，从而使细胞核着色。
4、染色结束后，用PBS或其他适当的缓冲液洗涤细胞或组织，以去除多余的染色液。
5、使用抗荧光淬灭封片液封片，以防止荧光淬灭。
6、将样本置于荧光显微镜下观察，激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左右。此时，细胞核应呈现亮蓝色荧光。
请注意，HOECHST33258染色液是有害物质，使用时需要做好防护，如带手套、口罩，穿实验服。同时，荧光容易淬灭，所以推荐使用防荧光淬灭封片剂封片，并在避光4℃下保存。另外，为确保结果的准确性，建议即时拍照保存结果。
三、应用
通过对鲜轮叶党参洗净、去皮,高压灭菌蒸汽锅105℃蒸1h,室温下(25℃)干燥,得到蒸制轮叶党参(steamedCodonopsislanceolata,SCL),SCL粉末用10倍体积甲醇40℃提取90min,提取3次,所得滤液用旋转蒸发仪浓缩,得到SCL粗提液,作为后期实验的样品及药品使用;通过HPLC和LC/MS分析了蒸制轮叶党参中的化学成分,检测到其含有党参炔苷及六种皂苷等成分,为其日后开发成药品打下基础。
此外,通过建立顺铂诱导的急性肾损伤模型,观察SCL的肾保护活性。结果表明:SCL能够降低小鼠血清中肌酐(CRE),尿素氮(BUN),炎症因子(TNF-α),白介素1β(IL-1β)的水平和肾组织中丙二醛(MDA)的含量;H&E和HOECHST33258染色说明SCL能够抑制细胞凋亡;免疫组化结果显示SCL各剂量给药组均在不同程度上降低了Bax的表达,并且升高了Bcl-2的表达,且呈现一定的剂量依赖性关系。这说明SCL对顺铂所致的急性肾损伤具有保护作用。我们还建立了急性酒精性肝损伤模型,观察SCL对肝损伤的保护作用。
结果显示：SCL有效地降低肝组织中ALT,AST和GSH的含量及血清中TG的水平;且能够显著性升高肝组织中MDA的含量;组织学分析表明SCL能够减弱酒精所致的肝损伤,总体结果说明SCL对急性酒精性肝损伤具有一定的保护作用。最后,对SCL主要活性物质——紫丁香苷(Syringin)对顺铂致急性肾损伤的保护作用进行研究。HOECHST33258染色液染色结果表明:Syringin能够显著降低小鼠血清中肌酐(CRE),尿素氮(BUN),炎症因子(TNF-α),白介素1β(IL-1β)和肾组织中超氧化物岐化酶(SOD),谷胱甘肽(GSH),过氧化氢酶(CAT)的含量;H&E,HOECHST33258及过碘酸-雪夫染色液(AB-PAS)染色结果表明:Syringin能够改善顺铂造成的肾损伤;免疫组化结果表明:Syringin能够降低Bax和Caspase-3的表达,并且升高Bcl-2的表达,上述结果表明紫丁香苷(Syringin)对顺铂所致的小鼠急性肾损伤具有保护作用。