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1、gus组织化学染色gus组织化学染色gus组织化学染色1.试验原理相宜的反应条件下，-葡聚糖苷酶（gus）可将x-gluc水解成蓝色物质，因此具有gus活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观看到。2试验材料1）转基因烟草叶片或试管苗2）非转基因烟草的叶片或试管苗（阴性对比）3药品试剂1)x-gluc，用n-n-二甲基酰胺配成20mm的贮存液，分装成每管100l，保存于-20。2)底物溶液（染色液）：3)1mmx-gluc加入100mm磷酸钠缓冲液（ph=7.0）,缓冲液中含10mmedta-na2，1-5mmk3fe(cn)6(铁氰化
2、钾)，1-5mmk4fe(cn)6(亚铁氰化钾)，0.001%（v/v）tritonx-1004试验器材小药瓶，培育皿，培育箱（37），微量移液器5试验步骤1)将预备好的叶片放入小药瓶，加入染色液浸没试材，封好盖子；2)37培育箱中温育1小时至过夜；3)将浸染过的试材转入70%或95%乙醇中脱色2-3次（除去叶绿素），至阴性对比材料呈白色为止。6结果叶片上gus活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点。先用dmso溶解x-gluc似乎是100mg/2mlpbf94ml+x-gluc0.1ml+tritionx-1002ml+fe2+2ml+fe3+
3、2mlgusstaining1.exciserootandleafsegments,washwith100mmpotassiumphosphatebuffer(ph7.0)for3times.gus组织化学染色2.immerseinthegussubstratesolution,37c,dark,12-24h3.rinseinphosphatebuffer4.fixfor4horlonger5.rinseinthesamebuffer6.observeaswholespecimensor
4、assections.1mpotassiumphosphatebuffer(ph7.0)k2hpo4:34.8g-200mlkh2po4:27.2g-200ml184.5mlk2hpo4+115.5mlkh2po4-300ml1mpotassiumphosphatebuffer(ph7.0)gussubstratesolutionvolume(500ml)finalconcentrationpotassiumferricyanide82mg0.5mmpotassiumferrocyanide105.6mg0.5mmpotas
5、siumphosphatebuffer(ph7.0,1m)50ml100mmstoreat-20c.add1mmx-gulc(mw521.80.5mg/ml)freshlywhenuse.fixsolution2.5%glutaraldehyde200mmsodiumcacodylate,ph7.2gus组织化学染色共培育后愈伤的瞬时表达、抗性愈伤的鉴定以及转基因植株的鉴定用gus组织化学法测定.将待测定的材料,如愈伤或叶片,浸入适量x-gluc溶液,于37保温过夜后,在体视显微镜下观看,拍照记录.若将加有x-gluc溶液的材料抽真空,染色
6、效果将更好.如材料存在色素干扰问题,染色后用酒精脱色,使色素的颜色褪掉而使染成的蓝色保存.x-gluc染色液：（20*）0.2mol/lna3po4缓冲液(62ml0.2mol/lna2hpo4;38ml0.2mol/lnah2po4)，ph7.0；0.1mol/lk3fe(cn)6;0.1mol/lk4fe(cn)6.3h2o;1.0mol/lna2epta;0.1%x-gluc.1000mlx-gluc1000mg（20mldmso）na2hpo4:620*0.2*m=0.620*0.2*358（12h2o）=44nah2po4:3
7、80*0.2*m=0.358*0.2*156（2h2o）=11k3fe(cn)6:1000*0.01*m=32926*0.01=3.3k4fe(cn)6:1000*0.01*m=42239（3h2o）*0.01=4.2triton1mlna2epta:1000*0.1*m=372.24(2h2o)=371.取5mgx-gluc(5-bromo-4-chloro-3-indolylglucuronide)溶於100ldmso於中.2.加入10mlreactionbuffer(10mmna2edta,100mmnah2po4h2o,0.1%triton,0.5mmpotassiumferricyanide,0.5mmpotassiumferrocyanide,ph7.0).3.混合匀称后分装於eppendorftube中,保存於-20冰箱内.100mlx-gluc染液配制x-gluc50mg加入溶入1mldmso1mltriton100na2edta(20mm)10mm5ml;k3fe(cn)6(0.1m)5mm0