实验十四植物病原真菌侵染过程的组织病理学观察
一、目的要求
学习组织整体透明染色技术和荧光染色技术,观察病菌在组织中的扩展过程和主要组织病理学特点,以增强学生对病原真菌侵染过程的了解。
二、基本原理
病原真菌侵染过程的组织病理学观察常用组织整体透明染色技术和荧光染色技术。组织整体透明的常用方法包括水合氯醛透明、甘油乳酸液水合氯醛透明、乳酸透明和吡啶透明等方法。
1.水合氯醒透明将小块组织在等量的酒精(95%)和冰醋酸混合液中固定24h,然后浸在饱和的水合氯醛水溶液中。待组织透明后取出用水洗净,经稀苯胺蓝的水溶液染色后，用甘油浮载镜检。
2.甘油乳酸液水合氯醛透明将小块标本或切片放在酒精和冰醋酸的混合液中固定,待叶绿素褪去后,标本移在载玻片上；加含有1%酸性品红的甘油乳酸液几滴染色,徐徐加热到发烟为止。然后,除去残余的甘油乳酸液,加几滴不含染料的甘油孔酸液(并加热),洗去多余的染料,移在水合氯醛的饱和溶液中,组织透明后即可检视。如要永久保存,可以用水合氯醛的饱和溶液作浮载剂,用贴金胶水或磁漆等封固。
3.乳酸透明病组织在乳酸(75%)中浸几天后即透明,组织中有颜色的菌丝体和子实体都可以看到。病菌结构如果是无色的,可用加0.5%~1.0%苯胶蓝的甘油乳酸液染色中检视。
4.吡啶透明小块叶片浸在吡啶中,很快即可褪色和透明,经过水洗或者直接放在甘油乳酸液中检视。
组织整体透明染色技术常用于在组织和细胞水平观察病菌的扩展过程。该法适于进行组织中病菌菌丝扩展的定量研究,可以揭示寄主和病原物相互作用的时空变化动态。但该法难以区分细胞的病理性坏死和机械创伤。荧光染色技术则能克服这一缺点,能更准确、快速地观察组织中病菌菌丝的扩展情况。组织荧光染色技术是研究病菌与其寄主之间相互关系的较为理想的方法。
三、材料、试剂与仪器
1.小麦品种和锈菌菌种供试品种由锈菌生理小种鉴别品种中或当地栽培品种中选取。试验菌种可以是小麦三种锈菌(秤锈菌、叶锈菌、条锈菌)中的任何一种。供试生理小种应能使各供试品种分别表现0,1,2,3~4等各级反应型。用所选小种的新鲜夏孢子作接种体。
2仪器与用具小花盆、毛笔、手持喷雾器、保湿筒(箱),单刃刀片、镊子、烧杯(50ml)、滴瓶、酒精灯、三角架、石棉网、载玻片、盖玻片、测微尺、普通显微镜、荧光显微镜等。
3.试剂50%和95%乙醇、棉蓝乳酚液(乳酚油配方为：乳酸20ml、苯酚20ml、20%甘油40ml、蒸馏水20ml。乳酚油中加入0.05~0.1%棉蓝)、25%和50%甘油液、水合氯醛、滑石粉、甲醇、氯仿、Tris－HCl缓冲液(pH8.5,0.1mol/L)、固定透明液(乳酚油：95%乙醇=1：2)、NaOH(0.5mol/L)、calcofluorwhite(0.1%)等。
四、实验步骤
{一}组织整体透明染色观察
1.植物材料培育和接种供试小麦品种饱满种子播于小花盆中,在16~20℃和日照12~16h的条件下育苗。幼苗第1叶片展平后接种。接种叶片用手指蘸水轻抹去叶表面的蜡粉(去蜡),用手指蘸取条锈菌新鲜夏孢子涂抹在叶片上接种,然后用手持喷雾器向接种叶片上喷水雾。再将花盆移入盛水的保湿筒内保湿12~24h后取出,培育(16~18℃,光照16h,光强不低于10000lx)。
2.取样和处理分别在接种后12h、24h、72h和96h取样。每次每品种摘取3个接种叶片,用单刃刀片将接种叶片切成2cm长的叶段,叶段的上表皮朝上,从顶部由左下方向右上方斜切成楔形,以便于透明,染色后区分叶片上、下表面。
3.样片检查和记载样片用显微镜镜检并进行显微计测。各品种每次取样的材料至少检查30个单个夏孢子侵入形成的侵染点。
检查和记载的项目有:
(1)吸器母细胞。统计各侵染点中吸器母细胞数目,计算平均数。
(2)菌落线性长度。用测微尺测定菌落线性长度,该长度指菌落两端最远处的侵染菌丝顶端之间的直线距离。若小菌落只在一侧产生侵染菌丝,则计测由气孔下囊至最长菌丝顶端间的直线距离。若不用测微尺测量,则可以气孔长度为单位,估计菌落线性长度相当于气孔长度的倍数。
4反应型记载各品种均保留部分接种苗,在接种后12~14d，已充分发病,反应型正常时,按常规分级标准,记载反应型级别。
(二)荧光染色观察
1.接种将锈菌夏孢子与滑石粉按1:10比例混匀,用毛笔将孢子粉涂抹于未脱蜡的麦叶表皮上,然后按常规方法保湿24h。
(1)将所取叶片切成2cm的叶段,放入甲醇－氯仿(1:2)透明液中,放置6h。
(2)转入固定透明液(乳酚油:95%乙醇=1:2)中煮沸1.5min,放置过夜。
(3)用50%乙醇冲洗2次,每次15min,然后用蒸馏水冲洗2~3次。
(4)转入。-SmolJLNaOH中漂白透明2次,再用蒸馏水迅速冲洗2～3次。
(5)在Tris-HCl缓冲液(pH8.5,0.1mol/L)中浸泡30min。
(6)用0.1%Calcofluorwhi-te(增白剂)(溶于Tris-HCl缓冲液,pH8.5,0.1mol/L)将叶段染色5min,迅速转入蒸馏水,并冲洗4次,每次10min。
(7)转入25%甘油液中,浸30min。
3.镜检用含少量乳酚油的甘油作浮载剂制片观察。镜检时,荧光显微镜的激发滤光片应为365m(或u激发),阻碍滤光片应为475nm,在此条件下,可清楚地进行观察。