1、实验室里常会遇到的关于血清的问题1.血清的运用领域血清：离体的血液凝固之后，经血凝块聚缩释出的液体，即血清。血清可以抗病毒,增强抵抗力血清属于生物制剂.小牛血清含在离开母体后自身产生的一些代谢物质，当然也包括一些生长激素，而胎牛血清绝大部分的物质来自于母体。血液凝固析出的淡黄色透明液体。如将血液自血管内抽出，放入试管中，不加抗凝剂，则凝血反应被激活，血液迅速凝固，形成胶冻。凝血块收缩，其周围所析出之淡黄色透明液体即为血清，也可于凝血后经离心取得。在凝血过程中，纤维蛋白原转变成纤维蛋白块，所以血清中无纤维蛋白原，这一点是与血浆最大的区别。而在凝血反应中，血小板释放出许多物质，各凝血因子也都发生
4、其组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。对血清的成分和作用的研究虽有很大进展，但仍存在一些问题。主要是：第一:血清的成份可能有几百种之多，目前对其准确的成份、含量及其作用机制仍不清楚，尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂类等尚未充分认识，这给研究工作带来许多困难；第二:血清都是批量生产，各批量之间差异很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保证每批血清的相似性极为困难，从而使实验的标准化和连
8、白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。因此，推荐在-20以下储存血清，并避免反复冻融。解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。请勿将血清置于37太久。若在37放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。6.血清融化后含有沉淀，是怎么回事？该沉淀是血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）聚集形成的凝块，这是血清的正常特性，不影响血清的品质，可以静置使其自行沉淀或离心后使用。7.血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理沉淀包含纤维蛋白和脂蛋白。这是正常特性，不会影响产品性质。血清中沉
10、血清中的蛋白降解，在血清瓶底部聚集形成果冻样成分。该血清不能继续使用，建议丢弃。9.如何避免沉淀？按如下操作可避免沉淀的产生：(1)解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。(2)血清分装冻存时，须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一。(3)勿直接由-20直接至37解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。(4)勿将血清置于37太久，否则血清会变得浑浊，同时血清中许多较不稳定的成份也会因此受到破坏，从而影响血清的品质。(5)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。(6)若必须做血清的热灭活，请遵守56，30分钟的
12、，否则由于沉淀的存在会使得所培养的细胞产生大量黑点，或者细胞表面将会覆盖一层油状物质，影响细胞的正常生长。为减少血清的损失，可以把有沉淀的血清收集起来进行离心处理，将上清液加入培养液使用（一般不建议采用过滤的方法除去沉淀，因为沉淀会堵塞滤膜而无法过滤）。11.如何避免沉淀物的产生我们建议您在使用血清的时候，注意下列的操作:解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20至4至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20至37)，实验显示非常容易产生沉淀物。血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。若必须做血清的热灭活，请遵守56，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度
14、他未知的病原微生物也可能存在（检测种类以外的其他病原微生物）伽马射线辐照在除菌过滤的基础上，进一步降低了微量病原微生物的存在可能性，为牛血清的“清洁和安全”打上了双保险，符合各种生物制品的安全要求。辐照对于各种具有代表性的病原微生物的灭活效果统计，详见下表（辐照剂量2535kGy）：名称种属微生物大小灭活效果(对数减少量Logreduction)大肠杆菌革兰氏阴性杆菌1.5-4.0um>6短小芽孢杆菌革兰氏阳性杆菌,芽孢0.6-2.5um>6白色念珠菌真菌(二相性)2-3um>6Acholeplasmalaidlawii支原体0.3-0
19、配制培养基的水质、容器不合格。可应用离心、过滤的方法去除这些黑点;(5)培养原代细胞中出现小黑点，可能是原代组织中的杂质，多次传代可以消除。16.细胞培养中如何防止黑点？(1)尽可能地减少血清冻融次数。(2)培养基无需37水浴。(3)培养基保持最佳PH值7.0-7.2。(4)严格控制配制培养基的水质，容器定期刷洗。(5)掌握细胞传代的最佳时机，细胞切勿生长过老。17.融化后血清的颜色和之前用过的血清颜色不一致是什么原因？正常的血清颜色是澄清透明的琥珀色，不同批次的血清由于血红蛋白含量的不同颜色会有深浅差异，颜色不会影响血清品质。18.牛血清对细胞及病毒滴度的影响血清是一种成分复杂
21、粒填充，从而影响细胞向四周扩展生长。3、细胞传几代后就出现脱壁现象，不能连续传代；质量较差的血清缺乏某种细胞的贴壁因子，会使细胞在传代过程中逐渐丧失贴壁的能力。细胞会从正常的贴壁状态，边缘开始萎缩，上翘。观察到的现象就是细胞表面不光滑，晃动细胞瓶会看到细胞表面有絮状物随培养液波动。随着传代次数增加，细胞萎缩的情况越来越严重，直到最终完全脱壁而死亡。4、细胞长的很好，致密的单层，状态也很正常，但是接毒后细胞基本不发生病变，做滴度检测几乎测不出抗原滴度。这种情况也许是因为血清中含有与接种的病毒有同源的特异性抗体。比如血清中经常会存在乙脑抗体，牛腹泻病毒抗体等，如果存在这些抗体，就会把接进去的
25、很多血清厂家都处于维持生存的状态，因此难以投入大量资金和人力来提高血清的质量。5、血清蛋白引起的疫苗纯化问题由于血清含有大量的不同分子量的未知蛋白和多肽类物质，势必会增加提取，分离，纯化的步骤，增加了下游纯化处理的难度，因此在疫苗纯化阶段给纯化工作带来很大的困难；疫苗产品中牛血清白蛋白残留量要求不高于50ng/剂，为达到纯化的目的，纯化工艺不得不添加新的仪器设备；在除去牛血清白蛋白残留的同时，也会损失大量的有效目的产物，从而降低了疫苗的产率；牛血清中的某些蛋白与目的产物的分子量接近，在纯化过程中不能完全被去除，由于血清残留而导致的生物制品不合格，或者因为杂蛋白含量大造成严重不良反应的情况时
26、有出现.因此也会严重影响疫苗产品的质量。6、改变培养液的pH值牛血清的pH理论值为7.08.0，培养基在加入规定量的碳酸氢钠后（即达到细胞生长所需要的渗透压），再加入10的牛血清，一般会使培养液的pH值发生改变。因此在使用过程中应注意pH的变化，如有必要可用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调pH到所需值。7、由于血清的营养成分丰富，非常适合细菌、真菌和支原体等生长。国产血清大部分采用手工分装，因此容易把微生物带入而使得血清被污染。使用前如果没有及时发现，将会把污染物带入正在培养的细胞中，而使得细胞不能正常生长。-10-如何判断胎牛血清质量一、外观拿到血清，最先接触的是血清
27、外观，对于缺少细胞培养经验的人来说，外观的判断尤为重要1、颜色根据血红蛋白含量的不同，胎牛血清可表现出黄色或红色，我国的细胞培养用血清标准是不高于20mg/dl，实际上，血红蛋白含量的高低对血清并无直接影响，这个指标的意义在于能体现出采血过程的严谨规范程度，良好的操作能降低血清的溶血。国产血清的采血点很分散，大多是由屠户采血后马上离心收集，所以很少会有溶血，表现出明亮的蜡黄色，当然，国产血清也很少有标准意义上的胎牛血清。进口胎牛血清或多或少总有点溶血，因为真正的胎牛血清凝血功能差，红细胞容易破裂。总的来说，国产的血清呈现出蜡黄。进口的血清，质量最好的呈现出谈黄、微红色，如Gibco16000
29、量纤维蛋白会析出形成沉淀。当然，进口的新生牛血清，一般牛龄都在2周左右，血清中的各种蛋白含量明显偏高，生产后血清可能会浑浊，甚至有大量沉淀。当然，购买回来的血清都是冰冻状态，使用时需要融化，融化过程最好在温度较低的状态下慢慢进行，否则沉淀相对较多，虽然沉淀并不直接影响血清的质量，但对细胞的显微观察有一定的阻碍。3、澄清度进口胎牛血清由于蛋白和脂类等物质含量低，表现为稀薄、清淡，而国产血清，因为绝大多数是新生牛血清，相对而言更加粘稠，颜色略深，这对于初步接触血清的人很难判断，但把两者进行对比，可容易分辨。二、主要技术指标目前国内血清的质量标准是2005版的中华人民共和国药典，主要指标有以下几点：
30、1、内毒素国产血清标准为不高于5EU/ml。内毒素是细菌破碎后细胞壁的成分，因此内毒素含量的高低可表现出采血到生产一系列过程中的无菌操作情况。目前，国产血清基本都能达到这一要求，很多进口胎牛血清内毒素含量反而更高，如Gibco26140，只要求不高于50EU/ml，高出我国标准10倍，即使是16000，也要10EU/ml，血清质量也未见影响。可见，内毒素含量偏高不影响质量，除非含量极高，预示着已经污染。2、总蛋白含量胎牛血清一般范围是30-40mg/ml，数值偏高，说明采血的牛龄偏大，不是胎牛，数值偏低，表明血清可能掺水了。3、血红蛋白标准为不高于20mg/dl，颜色越红，数值越高，反之，数
32、，结果也很不准确，进口胎牛血清大多定量检测。免疫球蛋白的数值能完全体现出采血的时的牛龄情况，国产血清，基本都是新生牛的，血清中容易产生IgM，IgG的含量也偏高，进口胎牛血清，不含IgM，IgG的含量也较低。7、其它不管是国产还是进口血清，都是不测抗生素的（无四环素胎牛血清除外）。国外，抗生素的使用很严格，用量也很少，每头奶牛的产品包括血清都可以溯源的，因此可以做到胎牛血清中不含抗生素或含量极低;国内，抗生素的滥用已成了普遍现象，国产血清中残留很高，对细胞培养极为不利，这是国产血清质量差的根本原因。三、血源市场上的血清血源主要分为中国、北美、南美和澳洲。1、国产血清质量差，这是公认的，主要原因