6-8周龄雌性C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；新西兰白兔由中国科学院遗传与发育生物学研究所动物实验中心饲养及免疫。
表达人CypA的重组质粒pET-30a-CypA、用于联合免疫的质粒pcDNA3.0-CypA由本实验室构建并保存；大肠杆菌TOP10、BL21(DE3)由本实验室保存；小鼠骨髓衍生的巨噬细胞(Bonemarrow-derivedmacrophage，BMDM)取自C57BL/6小鼠股骨骨髓，原代培养经巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导后使用。
α-糜蛋白酶、N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phep-nitroanilide四肽底物、脂多糖、LPS、弗氏完全佐剂购自Sigma公司；Trizol购自Invitrogen公司；AMV反转录酶、RNase抑制剂购自Promega公司；兔白细胞介素(IL-1β)多克隆抗体购自SantaCruz公司；DMEM培养基、胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；ROXReferenceDyeⅡ、SYBRPremixDimerEraser购自TaKaRa公司；ToxinEraserTM内毒素去除试剂盒、ToxinSensorTMChromogenicLAL内毒素检测试剂盒购自金斯瑞生物科技有限公司；QuantikineELISAMouseIL-1β试剂盒购自R&D公司；Superdex75TM16/60及HiTrapProteinGHP柱购自GEHealthcare并使用其AKTAFPLC蛋白纯化系统；紫外分光光度计SpectrophotometerND-1000为NanoDrop公司产品；TECANinfiniteM200PRO酶标仪购自瑞士Sunrise公司；7500实时定量PCR仪购自美国应用生物系统公司(AppliedBiosystems)；实验中所用盐酸胍、醋酸、辛酸、硫酸铵、葡萄糖、柠檬酸钠、柠檬酸、乙醇、二甲苯、冰醋酸等试剂均为国产分析纯。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
将pET-30a-CypA重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，37℃平板倒置培养过夜。挑取单菌落接入含1‰卡那霉素的LB液体培养基中，振荡培养6h后1:100接入2L1‰卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养至菌液OD600在0.6-0.8之间，留取少量诱导前全菌作为对照，在剩余培养液中1:2000加入异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)，37℃、200r/min诱导4h。500r/min离心15min收集菌体，取诱导前后菌体破碎并收集沉淀进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，鉴定目的蛋白的表达。包涵体经洗涤后使用6mol/L盐酸胍变性，12000r/min离心取上清，所得产物复性换液至含20mmol/LTris、20mmol/LNaCl的缓冲液中。利用Superdex75TM16/60分子筛纯化，收集产物进行SDS-PAGE分析以确定目的蛋白，使用Bicinchoninicacid(BCA)法测定蛋白含量。
将纯化CypA蛋白分别置于37℃培养箱中3、6、12、24、36、48、72h后取样进行SDS-PAGE分析，观察其降解情况。
使用以修饰过的粘菌素B(PMB)为配体制成的内毒素去除树脂装填柱子，纯化蛋白经0.22μm膜过滤除菌后上样，经洗脱去除内毒素后收集淋洗液，使用ToxinSensorTMChromogenicLAL内毒素检测试剂盒测定内毒素含量。
新西兰白兔正常饲养至体重为2000-2500g，观察7-10d，身体状态无异常备用。第一次免疫(1d)取质粒pcDNA3.0-CypA0.5mg和纯化CypA蛋白1mg与等体积弗氏完全佐剂(Sigma公司)乳化至混合物在水中不扩散，家兔背部皮下6-8点、双后脚皮下注射以联合免疫。第二次免疫(22d)和第三次免疫(36d)均使用0.5mg纯化蛋白和等体积弗氏不完全佐剂乳化至混合物在水中不扩散，家兔背部皮下4-6点免疫。检测血清效价，使用1mg纯化蛋白加强免疫一次(50d)。10d后，家兔颈动脉放血至死亡，取全血大约100mL置于4℃冰箱过夜，离心分血清约40mL，分装后-80℃保存备用。
血清离心取上清，用4倍体积60mmol/L醋酸缓冲液稀释，调至pH4.5。1:40加入辛酸，室温搅拌30min，4℃静置2h以上。离心收集上清，加入1/10体积的10×PBS，调至pH7.4，在4℃条件下，以0.277g/mL加入硫酸铵，搅拌30min，静置过夜。离心收集沉淀，溶于20mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)中，使用HiTrapProteinGHP亲和层析，以20mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)上样冲洗，0.1mol/LGly-HCl(pH2.7)洗脱。收集纯化抗体，透析换液至PBS中，BCA法测定含量。
制备小鼠BMDM细胞，加入M-CSF诱导，于37℃、5%CO2条件下培养至细胞分化贴壁，用细胞裂解液(150mmol/LNaCl，20mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)，1mmol/LEDTA，1%TritonX-100，10%甘油，蛋白酶抑制剂)收取细胞，4℃裂解30min，12000r/min离心取上清，加入5×上样缓冲液，95℃处理样品10min。同时，取菌体超声破碎后离心分离得到的包涵体，初步洗涤后于少量PBS中加入5×上样缓冲液，经上述处理后与细胞裂解液一同进行SDS-PAGE，将蛋白转移至PVDF膜(15V，25min)。用含1%BSA和5%脱脂奶的TBST封闭过夜，使用纯化后抗体以1:20000作为一抗，以鼠单抗β-tubulin(1:2000)为内参，室温孵育1h，TBST洗3次，每次10min。二抗为羊抗兔和羊抗鼠，1:5000稀释，室温孵育1h，TBST洗3次，每次10min，使用底物显色试剂盒曝光显影。
将在含10%FBS的DMEM培养基中原代培养经M-CSF诱导分化的BMDM使用细胞刮刀刮下，吹打混匀后计数，稀释至1×106/mL后接入12孔培养板中，37℃、5%CO2过夜培养至细胞贴壁。换为无血清DMEM培养基，加入不同剂量eCypA刺激其炎症因子产生。
移去细胞培养基，使用Trizol提取RNA，以oligo(dT18)作为引物，AMV反转录酶(Promega公司)经反转录反应获得cDNA，反应体系包括12μLRNA、4μLoligo(dT18)、16μL2.5mmol/LdNTPs、1μLAMV反转录酶、10μL5×AMV缓冲液、1μLRNase抑制剂，加双蒸水补充至50μL。使用实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测IL-1β、IL-6、TNFα的表达水平，反应体系包括2μLcDNA、0.2μmol/L引物、0.4μLROXReferenceDyeⅡ、10μLSYBRPremixDimerEraser(TaKaRa)，加入双蒸水补足到20μL。使用7500实时定量PCR仪进行qPCR反应，Ct值反应程序为第一步95℃30s，第二步共40个循环，包括95℃5s，60℃31s。每个样品重复3次，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)为内参，利用公式2-△△Ct计算其相对表达量。
用细胞裂解液收取细胞，SDS-PAGE后将蛋白转移至PVDF膜，封闭过夜，一抗为兔多抗IL-1β(1:2000)，二抗为羊抗兔(1:5000)，以鼠单抗β-tubulin(1:2000)为内参，利用Westernblotting检测IL-1β表达水平，具体方式同1.6.3。
收集每组细胞上清液，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定各组细胞上清中炎性因子IL-1β的含量。测定方法按QuantikineELISAMouseIL-1β试剂盒说明书进行，每组设3个重复，于490nm处读取OD值，绘制标准曲线并得出蛋白含量。
取6-8周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为空白组(PBS)、未治疗组(LPS)、治疗组(LPS+anti-CypA)3组，每组5只。空白组每只小鼠经鼻腔滴注50μLPBS，未治疗组和治疗组小鼠经乙醚麻醉后，每只小鼠经鼻腔滴注3μgLPS(溶于50μLPBS)。
取anti-CypA抗体200μg溶于300μLPBS中，于LPS诱导24h前腹腔注射给药一次，LPS诱导后随即再给药一次，共计两次。
末次给药18h后小鼠眼球取血，1:1加入阿氏液(Alsever’ssolution)中，使用Trizol提取RNA。同时取小鼠肺脏，称重后加入Trizol研磨，3000r/min离心5min去除沉淀后依照说明书操作提取RNA。经RT-PCR后利用实时定量PCR仪进行qPCR反应，以GAPDH为内参，利用公式2-△△Ct计算IL-1β相对表达量，实验方法及体系同1.7.2。
记录小鼠体重和肺重量，利用公式(肺指数=肺重/体重×100)计算肺指数。拍照记录小鼠肺表面形态，并沿支气管向肺叶中充入10%甲醛。分离肺叶于10%甲醛中固定48h，经脱水透明后包埋于石蜡中以制作病理切片，将切片经H&E染色后于镜下观察并记录。
以上试验结果表明，经LPS诱导的未治疗组小鼠肺表面可见明显出血点，肺指数较空白组显著上升，肺组织及血液中IL-1β表达水平较空白组显著增高，表明LPS诱导的小鼠急性肺炎模型建立成功。经anti-CypA抗体两次给药后的治疗组与未治疗组相比，肺表面出血点较少，损伤程度较轻，肺指数下降。其肺组织和血液中IL-1β表达水平与未治疗组相比下降显著，说明anti-CypA抗体在一定程度上阻止了LPS对小鼠肺脏损伤，减轻和缓解了LPS诱发的炎症反应，具有一定治疗效果。
我们成功建立了LPS诱导的小鼠急性肺炎模型，使用anti-CypA抗体进行治疗后，可以在一定程度上减轻和缓解炎症反应。本研究为促进anti-CypA抗体药物的临床应用进行了一次有益的探索，同时也为开发抗炎症药物提供了一种新的思路和策略。