本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种用于“阻滞型”生精障碍检测的基因集、其基因检测panel的制备方法及应用。
背景技术：
1、1985年，英国布里斯托大学hull等提出，生精障碍是一种严重的生育障碍临床疾病。1993年，who男性不育标准化检查与诊疗手册指出，生精障碍存在显著异质性，为了进行诊断分类，睾丸组织学类型可分为：1)在生精小管(或部分)内可见到精子：在大部分(或部分)生精小管内可见各级生精细胞；2)在生精小管内没有精子：无论是精子细胞水平、精母细胞水平，还是精原细胞水平发生的成熟阻滞，都称之为生精阻滞，在任何生精小管中均未见完整生精过程。然而，由于精子发生是一个动态变化的过程，且不同区域生精小管生精障碍呈显著异质性，因此目前的睾丸病理分型标准并不能完全反映内在生精状态，亟需统一规范的临床诊疗策略与体系。
2、上海交通大学李铮团队依托国家重点研发计划——精子发生障碍病因学及临床防治研究(2022yfc2702700)，基于9,615例生精障碍患者临床样本库及504例家系样本库，综合考虑患者的生精情况，从临床表型、发病原因、发病过程、治疗及预后5个维度创新性提出将生精障碍分为3种亚型：1)生精小管形态各异，多数小管无精子仅孤立小管有精子的“局灶型”；2)生精小管形态相近，生精细胞分化阻滞于精母细胞与精子细胞的“阻滞型”；3)生精小管破坏或萎缩，仅存支持细胞或偶见精原细胞的“衰竭型”。其中，约60％“阻滞型”生精障碍由遗传因素引起。因此，亟待开发一种新工具对该类患者进行高效且精准的遗传学诊断。
3、随着人类基因组测序计划完成和高通量测序技术的发展，医学领域的科研工作者对人类基因组有了更深入的认识，对疾病遗传变异、致病基因的功能及作用机制的研究也逐渐深入。目前应用较为成熟的全外显子测序(wes)技术，是利用外显子捕获试剂盒捕捉整个基因的外显子及其周边区域的基因序列，然后进行高通量测序，因其花费小，产出数据率用率高的特点在各种遗传疾病研究中崭露头角。近几年来，因测序成本由近万元大幅下降至钱百元水平，使得其作为临床常规检测成为可能。
技术实现思路
1、本发明的目的是克服现有技术中缺乏有效的生精障碍检测技术的缺陷，提供一种用于“阻滞型”生精障碍基因集panel检测设计方法，该panel包含了用于“阻滞型”生精障碍检测的全部类型基因，基因覆盖度广，可以用于从该类疾病的风险评估到诊断、治疗、预后等各个阶段，并且可移植性强，适用于目前国内市场的测序仪器或新开发的检测平台。
2、为了达到上述目的，本发明提供了一种用于“阻滞型”生精障碍基因检测panel的制备方法，包括以下步骤：
6、步骤五，将步骤四中选择的基因目标区域两端延伸，默认长度为50bp，合并全部选择区域后去冗余，最终形成探针设计的bed文件，该bed文件包含目标区域的染色体编号、目标区域的起始位置、目标区域的终止位置、自定义信息；
7、步骤六，panel探针设计：根据步骤四中选择的目标区域，从人类基因组中可设计探针数据集中寻找可以设计探针的设计区域，根据设计区域和探针设计参数生成探针；
9、步骤八，panel合成：在步骤七中设计的探针两端添加固定的扩增序列，合成dna单链，pcr扩增，转录成rna探针，添加生物素标记，得到“阻滞型”生精障碍基因检测panel。
12、较佳地，步骤二中所述敲除/变异后小鼠表型为“阻滞型”生精障碍且在人中存在同源基因的收集是通过mgi(mousegenomeinformatics)数据库中敲除/变异后小鼠存在生殖系统表型，且表型描述中存在“arrestofspermatogenesis”字条的基因，并通过ncbi的homologene数据库中查找其人同源基因。
14、较佳地，步骤六中所述可设计探针数据集是将基因组的alu重复区域、串联重复区域、假基因中重复度高或者组装质量低的区域剔除之后形成的可以进行捕获探针设计的数据集。
15、较佳地，步骤六中进行panel探针设计时，对设计区域的探针设计覆盖进行加权，覆盖度加权数据是根据全基因组测序数据预测出某些区域存在过高或者过低的深度，对这部分区域进行量化标记，以达到最终设计出的探针能均匀捕获目标区域的目的，其中加权公式如下：
16、
17、公式中，x1、x2、x3…xk是高于/或低于平均探针深度的数据，f1、f2、f3…fk是各个探针深度数据对应的权值，k是过高/过低的深度统计数量，是指平均探针深度。
18、较佳地，所述“阻滞型”生精障碍基因检测panel固定在基因芯片的硅片或玻片上；或者采用液相反应池，rna单链探针不固定在固相载体上。
20、本发明还提供了一种用于阻滞型”生精障碍基因检测panel的应用，所述“阻滞型”生精障碍基因检测panel用于制备基因芯片、“阻滞型”生精障碍检测装置、“阻滞型”生精障碍检测试剂盒中的任意一种。
21、相较于现有技术，本发明的有益效果至少包含：
23、(2)本发明包含了高通量测序的检测结果，该部分针对“阻滞型”生精障碍患者的基因变异检测结果筛选出致病基因，故设计出的基因panel更适合于“阻滞型”生精障碍的检测。
24、(3)本发明开发的基因panel适用于自主开发的测序仪器，相较于目前商业公司的检测方法而言，本发明的panel检测平台对基因的检测和分析成本更低，适用范围更广，极具推广价值。