目的基因序列合成以及质粒构建由上海生工公司完成，将含有目的基因序列的pET-30a(+)质粒转入到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)宿主菌种。
层析介质CMSepharoseFF、制备型Superdex75介质购自GEHealthcare公司(美国)，多柔比星和DOXO-EMCH均购自北京乐博生物有限公司(MCE，美国)，其他试剂均为国产分析纯。
KTApurifier层析系统(GEHealthcare，美国)；紫外-可见分光光度计(GEHealthcare，美国);SuperdexTMpeptide高效凝胶过滤柱(GEHealthcare，美国);圆二色光谱仪(JASCO，日本)；荧光分光光度计(Hitachi，日本)。
发酵菌体使用缓冲液(20mmol/LPB，1mmol/LEDTA，pH6.0)按20%菌体浓度的比例重悬，使用APV-2000高压均质匀浆机进行菌体破碎，破碎压力为800~900bar，重悬菌液循环三次，然后10000r/min离心30min，收集上清液，冷藏备用。
CM-Sepharose色谱纯化：自装CM-SepharoseFF层析柱(XK16×100mm)以bufferA(20mmol/LPB,pH6.0)充分平衡，再取菌体破碎上清液，以bufferA稀释3倍降低电导后上样。上样完毕后用bufferA继续淋洗5CV，然后以25%bufferB(20mmol/LPB,1mol/LNaCl,pH6.0)阶跃洗脱目的蛋白，流速均为5ml/min。
Superdex75色谱纯化：Superdex75预装柱(XK26×600mm)以bufferC(20mmol/LPB,0.1mol/LNa2SO4，pH7.0)充分平衡，阳离子层析洗脱蛋白直接上样，上样量为10ml。然后继续以bufferC洗脱，收集目标蛋白峰，流速均为3ml/min。
将纯化获得的多肽与人血清白蛋白按1:0,1:1,1:2,和1:3摩尔浓度比例混合10min，注意应保持各组混合液中白蛋白结合肽的浓度一致。之后使用高效凝胶过滤色谱(Superdex75HR分析柱)以同等上样量分析各组多肽的结合效率。
将多肽-多柔比星耦合物与多肽分别置换至50mmol/LPB，pH7.0的缓冲液中，测定蛋白浓度并将最终浓度稀释至0.5mg/ml，然后将样品载入0.1cm光径的样品杯中，使用J-810圆二色光谱仪(JASCO,日本)扫描260~190nm波段的信号，扫描波长间隔为1.0nm，扫描重复次数为5次，样品扫描速度为1200nm/min。以空白缓冲液信号作为参考校正。
将多肽-多柔比星耦合物、多肽及DOXO-EMCH的浓度分别稀释至0.2mg/ml，然后将样品载入1.0cm光径的石英样品杯中，使用荧光分光光度计(Hitachi,日本)，设置荧光激发波长为480nm，扫描500~650nm波长范围内的荧光发射信号，扫描波长间隔为1.0nm，扫描重复次数为5次，数据按5次平均值处理。
将A549细胞以1×104/孔的密度接种至96孔板，接种体积为100μl。将细胞于5%CO2培养箱中37℃孵育过夜，待其贴壁。然后分别加入0.01~70μmol/LDOX当量的DOX、DOXO-EMCH及多肽-多柔比星耦合物，继续培养60h。作用结束后，去除药物，PBS洗涤各孔细胞3次，然后再向各孔补足100μl新鲜培养基，并加入10μlCCK8试剂孵育2h。最后用酶标仪测定各孔细胞在450nm的吸收值，绘制细胞存活曲线，并采用GraphPadPrismv5.0软件计算各药物的IC50值。每组药物均设置三个复孔。
选用4周龄的雄性BALB/c裸鼠，将A549细胞以1×106/ml的密度接种至其右前肢腋下，待肿瘤体积达到100~150mm3时，随机将肿瘤裸鼠分为4组，每组6只。分别将生理盐水、多柔比星、多柔比星马来酰亚胺衍生物以及耦合物按3mg/kg的多柔比星当量进行皮下注射给药，给药间隔为4天/次，共给药4次。每两天测定各组裸鼠的肿瘤尺寸，并计算肿瘤体积，公式为：体积=(长×宽2)/2。