经眼玻璃体给药药物的研究进展及非临床研究的考虑要点
《药学学报》2023年
作者
付淑军，于冰，廖琴，孙涛
国家药品监督管理局药品审评中心
昭衍（苏州）新药研究中心股份有限公司
摘要
关键词
眼科治疗药物；玻璃体；经眼玻璃体给药药物；非临床研究
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正文
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概述
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经眼玻璃体给药药物的研究进展
2.1眼玻璃体的解剖与生理特点[3,4]
眼玻璃体是无色透明的凝胶体，位于晶状体后面的玻璃体腔内，占眼球内容积的4/5，成人玻璃体腔容积约为4.5mL。晶状体后部位于玻璃体前部的凹面内，玻璃体其他部分附着于睫状体和视网膜的内表面。玻璃体周边部的胶原纤维排列紧密，形成玻璃体膜，位于晶状体后表面和睫状体平坦部（又称玻璃体基底部）的为玻璃体前界膜，从前界膜到视盘边缘处为止的为玻璃体后界膜。玻璃体与视网膜附着最紧的部位是睫状体平坦部，其次是视盘周围、黄斑中心凹部和视网膜的主干血管部。玻璃体表面与视网膜相连的是皮层玻璃体。玻璃体与视网膜的连接由玻璃体皮层和视网膜的内界膜组成。
玻璃体由水（约占98%）、胶原、透明质酸及其他蛋白多糖和糖胺多糖以及很少的玻璃体细胞组成，是眼屈光介质的组成部分，对光线的散射极少，透明可导光。玻璃体构成血-玻璃体屏障（又称视网膜玻璃体屏障），能阻止血管内的大分子进入玻璃体。正常玻璃体能抑制多种细胞增生，维持玻璃体内环境的稳定。玻璃体内无血管、无神经，其所需营养来自房水和脉络膜，代谢较为缓慢，不能再生，缺损后留下的空间由房水填充。随着年龄的增加，玻璃体内透明质酸溶解、胶原网状结构塌陷，可引起玻璃体凝缩、劈裂、后脱离（玻璃体和视网膜内界膜分离）和液化等组织学变化，而眼内炎症、玻璃体积血、长眼轴等多种状态也可引起玻璃体后脱离。当玻璃体变性或液化甚至脱离时，其透明度受影响且易导致视网膜脱离。
2.2不同种属玻璃体的比较
不同种属的眼球尺寸和玻璃体腔大小不同，经玻璃体给药可容纳的药物体积亦有不同（见表1）。
玻璃体结构成分的相对组成存在着物种和年龄上的差异[5,6]。不同动物种属的玻璃体结构差异与透明质酸浓度的差异有关。与人和非人灵长类相比，兔、狗、猫和啮齿动物玻璃体的透明质酸浓度相对于胶原蛋白较低，而恒河猴的玻璃体在胶原蛋白和透明质酸含量、结构特征和老化方面与人类的玻璃体最为相似[7]。因此，在经眼玻璃体给药药物的非临床研究中应考虑到动物玻璃体大小的差异和年龄带来的玻璃体组织性质不同，及其对药物分布和毒性的影响。
2.3经眼玻璃体给药药物研究进展
眼科药物多通过眼局部给药，包括外眼、眼表、眼周（如结膜下、球后和眶内注射）、球壁（如细胞和基因产品的视网膜下注射和脉络膜上腔注射）和眼内（玻璃体腔注射及前房注射等）给药，少数眼科用药通过全身途径如口服和静脉注射等给药。经玻璃体给药属于眼内给药，采用的方式为玻璃体腔注射和玻璃体腔植入，前者主要用于一些能够通过针管或装置直接注射的液体剂型或缓释剂型，后者主要用于一些特殊递送装置的手术植入。
2.3.1玻璃体腔注射给药
玻璃体腔注射（intravitrealinjection,IVT）是一种有创的给药方法，但注射后可使玻璃体和视网膜内的药物浓度达到较高水平，是多种眼底病的有效治疗手段。随着需要IVT治疗的疾病种类及患者数量的快速增长，有关IVT注射方法和技术的临床证据也越来越多。2014年12月美国专家小组根据新证据更新了玻璃体腔注射技术指南[11]。2015年12月中华医学会眼科学分会眼底病学组发布了我国视网膜病玻璃体腔注药术质量控制标准[12]。2018年2月欧洲视网膜专家学会（EURETINA）基于IVT最新流行病学数据更新发布了玻璃体内注射建议，认为已有的临床证据显示IVT注射总体上是安全的，IVT注射后发生眼内炎或其他并发症的风险极低，而这些风险升高往往因未按照安全规范操作[13]。
国内外获批上市的玻璃体腔注射药物主要包括抗血管内皮生长因子（VEGF）类药物、激素和酶，具体信息参见表2[1,14-20]。目前，通过玻璃体腔注射应用于眼部疾病的新型治疗药物也已在临床试验阶段，如小分子酪氨酸激酶抑制剂sunitinib[17]、抗体-生物聚合物偶联物、基因治疗产品（如纽福斯生物的NR082，rAAV-ND4，用于Leber遗传性视神经病变）等，为更多罹患眼科疾病甚至是遗传性眼病的患者带来了新希望，也对非临床研究提出了挑战与思考。
2.3.2玻璃体内植入给药
可生物降解的玻璃体内植入物：如2017年NMPA批准的首个地塞米松玻璃体内植入剂Ozurdex（含0.7mg地塞米松，载体材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物），用于治疗RVO继发的黄斑水肿，由于药物释放和支架在玻璃体腔内的逐渐降解，药物浓度呈指数级下降，有效性可持续至植入后3~6个月；又如溴硝柳胺药物输送系统（BrimoDDS），在一项II期临床研究（NCT00658619）中被用于治疗继发于wAMD的地图样萎缩患者[1]。
非可生物降解的玻璃体内植入物：如Retisert（0.59mg醋酸氟轻松）/Illuvien（0.19mg醋酸氟米龙），通过聚合物共轭形成，药物在玻璃体内可持续释放2至3年，药物浓度在封闭的玻璃体腔内呈稳定的线性下降，但这些装置仍然留在玻璃体腔内，需手术取出[1]；Vitrasert（Bausch&Lomb,Rochester,NY,USA），在眼内持续释放更昔洛韦，用于治疗巨细胞病毒视网膜炎[1]。2021年10月FDA批准了雷珠单抗港式递送系统（portdeliverysystem,PDS）用于治疗wAMD的上市申请。PDS是一种先进的不可降解、可补充的植入物，通过手术固定在巩膜上，由于浓度梯度而产生的被动扩散使药物从端口移动到玻璃体腔，多孔金属元件可实现药物持续和可控释放，减少了玻璃体腔注射的次数，提高了患者的顺应性[21]。
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经眼玻璃体给药药物的非临床研究
3.1实验动物选择
啮齿类动物（如小鼠和大鼠）可用于全身安全性研究，但也需考虑其潜在免疫原性反应对实验可能产生的影响。如Eylea的非临床研究中发现，在大鼠或小鼠中可产生与肾病有关的抗体反应和清除率的提高，故不能用于开展更长周期的Eylea的全身安全性重复给药毒性实验[16]。
非啮齿类动物中，犬和猴的眼球大小和解剖学及生理学上与人眼相似，有利于眼部给药（尤其是玻璃体腔给药）和眼部检查，也是眼科药物毒性研究的常用动物，如Lucentis、Eylea和Beovu等的研究中均使用食蟹猴作为关键性安全性评价的动物模型，但犬的眼底有富含色素的毯层，有可能结合药物并改变其生物利用度[25]。近年来，由于小型猪眼底没有毯层结构、有类似于人类的视锥细胞和视杆细胞比率[26]，在眼科药物研发中的应用越来越多。
3.2受试物
受试物是非临床研究与评价的物质基础，其质量和配制的准确性是获取可靠结果的前提。通常非临床试验使用的受试物应与拟用于临床试验的产品具有可比性。在安全性评价试验中更应加强受试物检测，一方面申请人应提供符合拟定质量标准的受试物，且受试物的有效期满足实验周期的要求，可通过提供质验报告和稳定性研究报告来体现；另一方面研究机构负责研究用受试物的质量、稳定性和浓度一致性等[27]。但是，由于经玻璃体给药药物在给药后接触的组织（角膜内皮细胞、虹膜-睫状体、晶状体和视网膜）敏感性高，暴露的玻璃体腔空间小且密闭、玻璃体液循环缓慢，对此类药物的质量控制应更为严格。此外，对于实验中研究用IVT受试物，由于对其进行分装、复溶、稀释等配制操作可能引起药液污染、内毒素超标等严重影响实验结果的情况，且单支临床拟用装量的IVT用受试物基本可以满足每只动物单眼或双眼的应用，故建议直接采用不同浓度、临床拟用装量的研究用受试物。
3.3非临床药效学研究
3.3.1基本考虑
3.3.2药效学模型及指标
非临床药效学研究一般选用经典、公认的模型，新方法、新模型应进行充分的验证[29]。目前，经眼玻璃体给药已上市药物的非临床药效学研究以及研究文献报道中，已有多种体外和体内模型应用较广且经临床前及临床试验验证，如：针对眼底新生血管性疾病的抗VEGF类的生物制品，体外研究包括受试物与不同种属/不同亚型靶标结合的亲和力实验、抑制内皮细胞的生长实验、抑制VEGF诱导的血管内皮细胞的迁移实验、抑制VEGF诱导的血管内皮细胞出芽实验等，体内研究模型有激光诱导的猴及啮齿类动物脉络膜新生血管（choroidalneovascularization,CNV）模型、氧诱导的幼鼠（大鼠、小鼠）视网膜病变（oxygeninducedretinopathy,OIR）和DL-A-AAA（DL-Α-氨基己二酸）诱导的兔视网膜新生血管（retinalneovascularization,RNV）模型等[15,16,18,19,30]；针对眼部炎症的药物（多为激素类小分子），可采用外源性VEGF玻璃体内注射诱导的兔或大鼠视网膜渗漏/通透性增强（血-视网膜屏障损伤）模型、氧诱导的幼鼠（大鼠）视网膜病变等模型[20,21,31]。
3.3.3案例[18-20]
3.3.3.1Brolucizumab
体外药效学：采用表面等离子共振技术（surfaceplasmonresonance,SPR）检测了与不同种属（人、小鼠、猪、猫、兔）及三种hVEGF-A主要亚型的结合力；考察了对huVEGF165诱导的人视网膜内皮细胞迁移、牛视网膜内皮细胞增殖的抑制作用，并与Lucentis对比。体内药效学：在VEGF诱导的大鼠视网膜病变模型中，单次IVT注射给药，brolucizumab可剂量依赖性抑制VEGF诱导的视网膜血管通透性增加；在氧诱导新生大鼠视网膜病变模型中，brolucizumab可明显减少视网膜前新生血管形成；在激光诱导脉络膜新生血管化小鼠模型中，brolucizumab腹腔或IVT注射均能抑制小鼠CNV形成。
3.3.3.2Ocriplasmin
体外药效学：比较了ocriplasmin与天然人纤溶酶的酶学性质、底物特异性和底物降解效率；使用动态光散射法评估猪玻璃体内注射ocriplasmin致药物性玻璃体溶解后的玻璃体动态特性。体内药效学：未开展。由于缺乏适合的动物模型，申报者提交了一系列的文献资料用以支持ocriplasmin在诱导后部玻璃体脱离和玻璃体液化方面的活性。
3.3.3.3Faricmab
体外药效学：SPR结果显示本品与不同种属（人、食蟹猴、小鼠、兔）全长Ang-2、不同种属（人、小鼠和大鼠）受体结合域Ang-2-RBD-Fc具有高亲和力，本品与人VEGF-A121、VEGF-A165及大鼠VEGF-A121具有高亲和力，与小鼠VEGF-A121不结合；本品Fc区作了突变设计以防止与Fc受体结合，未见与人Fcγ受体（I/IIa/IIIa）或人、食蟹猴和小鼠的FcRn受体的结合。体内药效学：采用激光诱导的食蟹猴CNV模型评价了faricmab对CNV的抑制作用，IVT注射给予本品可剂量依赖性的改善激光诱导的眼底新生血管渗漏，优于相同剂量的RO5485202（一种靶向Ang-2的单克隆抗体）和相同摩尔剂量的lucentis。
3.4非临床药代动力学研究
3.4.1基本考虑
由于眼部复杂的解剖结构和动态生理屏障，获得眼组织的药代动力学参数难度更大。经玻璃体给药后，药物可直接进入玻璃体腔，但由于玻璃体液具有凝胶样性质，药物在玻璃体液中分布不均匀，可能需要几个小时才能扩散到整个玻璃体液中。药物的分布还取决于其分子量和理化性质，如结构、溶解度、logP、稳定性等。表面电荷的存在也会影响药物在眼组织中的分布，如阳离子脂质聚合物可以与玻璃体内带负电荷的透明质酸相互作用，导致聚集并最终固定在眼组织内。药物在玻璃体内达到平衡后，可通过视网膜或前房经房水消除。由于视网膜色素上皮细胞（RPE）的阻碍，药物从玻璃体腔到脉络膜的渗透缓慢，从玻璃体到视网膜的扩散也受到内界膜的限制。影响玻璃体腔内的药物浓度及其消除的因素包括初始剂量、分布容积、清除率和消除半衰期等[34-36]。
对于经玻璃体给药药物，其眼组织分布考察尤为重要，通常采集的眼部组织包括角膜、房水、虹膜、晶状体、巩膜、玻璃体液、视网膜、脉络膜、视神经等；根据品种的特点，有时也可能需要增加其他组织。在采集眼组织样本时需注意，由于动物安乐死后,眼组织中的生物屏障会迅速破坏,药物会在整个眼组织中迅速达到平衡，应迅速摘取眼球并立即放入液氮或干冰中保存,以防止药物转移到邻近组织中或被代谢消除,解剖分离眼组织时也应全程在冷冻状态下完成。样品分析与一般药物要求基本一致。但在对眼组织样品进行生物分析时,由于眼组织样本较小,考虑到3R原则，剖杀大量动物来获得对照基质比较困难,可采用与眼组织样品高度相似的替代基质。玻璃体液因含有胶原蛋白、透明质酸及其他蛋白聚糖而具有凝胶样性质,药物在其中不均匀分布,因此应将全部玻璃体液混匀后再取样分析[28]。
3.4.2实验模型
此外，眼部药代动力学经常通过隔室模型进行模拟，可以将眼睛的每个组件视为由屏障与其他隔室隔开的不同隔室，假设药物在眼部每个组织中分布均匀。已有文献[39]报道眼部药物递送的药代动力学隔室模型，用于描述眼部药物在眼中的吸收、分布和消除，包括两室、三室、四室和五室模型。但隔室模型的一个主要缺点是缺乏有关各种眼部结构局部分布的详细信息。
药物特性以及正常或疾病模型会影响其PK/PD结果[41]，如与正常动物相比，具有受损血视网膜屏障（blood-retinalbarrier,BRB）的动物模型会具有更高的药物消除率；在疾病动物模型中还观察到更高的玻璃体内清除率，实验设计时须予以考虑。
对于基因治疗产品，则应根据《基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（试行）》要求，生物分布研究应在临床试验开始前完成，同时需根据基因治疗产品的特点评估开展脱落分析的必要性[22]。
3.4.4案例[18~20]
3.4.4.1Brolucizumab
①食蟹猴静脉注射给药PK；②新西兰兔右眼单次玻璃体腔注射给药组织分布（房水、玻璃体液、视网膜、RPE-脉络膜），其中玻璃体液Cmax水平最高；眼内组织中半衰期大约为3天，在视网膜中最长（82h)，其次为RPE-脉络膜（77h)，玻璃体液t1/2为71h；③食蟹猴单次玻璃体腔注射给药组织分布[双眼房水、玻璃体液、中央视网膜、外周视网膜、中央脉络膜（带有RPE）和外周脉络膜（带有RPE）]，RTH258在眼组织中的t1/2为50~59h，在玻璃体液中暴露量最高，其次是外周视网膜，在外周脉络膜最低；游离药物的全身暴露水平较低，血清Cmax为60.9ng·mL-1，AUC0-168h为3430ng·h·mL-1，t1/2为78h。
3.4.4.2Ocriplasmin
3.4.4.3Faricmab
3.5非临床安全性研究
3.5.1基本考虑
3.5.2眼科检查
经眼玻璃体给药药物经玻璃体注射或植入后，眼科检查包括详细和系统的活体眼科检查和眼组织病理学检查，两者相结合能更全面地评估受试物潜在的眼部毒理学效应。
需特别注意的是，对于经眼玻璃体给药药物，玻璃体给药带来的机械损伤可能不可避免，实验中除尽量避免减少外，还应根据药物的作用机制、剂量-反应关系等对这类药物的毒性实验结果仔细分析评估及确定未见不良反应剂量（noobservedadverseeffectlevel,NOAEL）。对于某些眼部病理改变，需确认是否为药物引起的不良反应，不能简单归因于机械损伤，必要时应开展额外的附加实验以证明其分析结论，为临床试验风险控制提供支持。
由于玻璃体给药对注射操作、制剂质量的要求较高，而注射操作规范或失当、制剂质量的高或低和不同给药剂量或体积的受试物在不同动物种属眼部都可能产生不同的异常反应，故在正式毒理实验开展前还应重视在规范注射技术的情况下开展眼内制剂筛选、局部耐受性考查及毒性剂量探索等研究。
对于基因治疗产品，则应根据《基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（试行）》[22]要求，毒理学实验设计应综合考虑基因治疗产品本身的特点和临床应用，对其进行全面的安全性分析评价，必要时还应评价导入基因的表达产物的安全性。
3.5.4案例[18~20]
3.5.4.1Brolucizumab
探索性毒性实验：①食蟹猴IVT给药5周（Q5W*2剂，非GMP产品）观察到眼部炎症，ERG及视网膜组织学改变，分析可能是受试物被内毒素（0.316EU/眼）污染。②食蟹猴IVT给予等剂量的非GMP或GMP批产品6周（Q6W*2剂）给药分别可导致3/3眼，1/3眼明显眼毒性。③作为实验①的后续研究，在单剂量给药的食蟹猴中仍观察到严重眼部炎症，认为与此批次受试物的内毒素含量（≥0.042EU/眼）高有关。④兔单次IVT给药后监测制剂中辅料（蔗糖和枸橼酸钠）的毒性。⑤兔（0.025EU/眼）制剂内毒素筛选实验。重复给药毒性实验：食蟹猴IVT给药6周恢复期3周（Q3W*3剂，原液每眼0.5、1、3mg）、IVT给药6个月（Q4W*6剂+恢复期4周，原液每眼1、3、6mg）、IVT给药3个月（Q4W*3剂+恢复期4周，制剂变更，每眼6mg），均未见明显眼部及全身毒性。
3.5.4.2Ocriplasmin
安全药理学：大鼠和犬单次IV给药观察了对中枢神经系统、呼吸及循环系统功能的影响。单次给药毒性：①兔（玻切或不玻切）、猴、小型猪单次IVT给药，可见视网膜血管变窄伴视网膜萎缩、眼压、眼部炎症和ERG的改变及晶状体半脱位等眼部毒性反应。②大鼠单次IV给药。重复给药毒性：①食蟹猴单眼给药2次（间隔28天，每眼75、125μg）观察12周，可见晶状体半脱位及变性、眼压升高、眼部炎症、虹膜震颤、玻璃体混浊、ERG改变等。②大鼠、犬2周IV重复给药毒性伴随TK实验，大鼠中未见明显异常，犬可见流涎、干呕、呕吐、激动、吠叫。特殊毒性研究：奥克微纤溶酶及其溶剂、PichiaPastoris酵母表达系统提取液对大鼠行为异常的影响研究。
3.5.4.3Faricmab
安全药理实验：未单独开展，结合在2个月、6个月猴重复给药毒性实验中观察。单次给药毒性：食蟹猴单次玻璃体腔注射PK实验中初步观察了眼局部耐受情况。重复给药毒性实验：食蟹猴IV注射给药2个月（Q4W*3剂）及IVT给药2个月（Q4W*3剂）和26周（Q4W*7剂）。在两项IVT重复给药毒性实验中，活体眼科检查项目包括裂隙灯和检眼镜检查、眼压、眼底照相、FA、OCT和ERG，主要不良反应均为眼内炎症反应。眼组织病理学检查除了对眼球（带视神经）及其附属器进行了常规染色和光学显微镜镜检，对出现眼部炎症的部分动物眼部组织进行IHC染色检查。在猴2个月重复给药毒性实验中还可见主动脉炎症。生殖毒性实验：猴胚胎-胎仔发育毒性实验：妊娠食蟹猴自妊娠第20天开始每周一次静脉给予本品（共5次），未见母体动物毒性、妊娠丢失或胎仔发育毒性及致畸作用。其他实验：人组织交叉反应实验、健康人血细胞体外细胞因子释放及免疫细胞耗竭实验；人血清补体活化体外评价实验。
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结语及展望
此外，随着科技的发展，用于眼科给药的新技术也不断涌现，如眼部微透析技术，其能够持续监测各种组织和细胞液中的药物浓度[46]，可用于局部、全身和玻璃体内给药后的药物浓度采样和分析。由于玻璃体液的体积小，因此该技术可以成为玻璃体腔注射药物药代动力学研究的有力工具。而影像学技术、定量整体动物自显影技术（quantitativewhole-bodyautoradiography,QWBA）等近年来也常用于眼科的非临床研究中。
目前，越来越多的经玻璃体给药的新型治疗药物进入临床试验阶段，对非临床研究提出了更多的挑战。考虑到经玻璃体腔给药药物的特殊性及前沿性，在药物研发过程中，鼓励申请人就试验策略、设计、结果分析等与审评机构沟通交流，以推动国内眼科药物的发展，为更多罹患眼科疾病的患者能够尽早获得安全有效的药物治疗做出贡献。