在各种肿瘤治疗策略中,细胞程序性死亡被认为是肿瘤治疗的主要方法之一。近年来报道了许多新的非凋亡细胞程序性死亡形式(包括铁死亡和自噬),揭示了细胞凋亡之外的分子机制。自噬在细胞死亡中起着关键作用,被认为是一种与ATGs、Beclin-1、mTOR和p53的修饰有关的自我降解机制。铁死亡是一种基于ROS介导的脂质过氧化引起的非凋亡细胞程序性死亡,受ROS生成、GPX4催化的谷胱甘肽(GSH)与ROS反应以及脂质过氧化的调节。因此,铁水平调节、铁储备和铁转运等因素可能影响铁死亡的发生。GPX4催化的谷胱甘肽中和多余ROS是铁死亡的主要调控过程。根据上述资料,天然化合物诱导自噬和铁死亡是癌症治疗的一个新的研究领域。
ResultsandDiscussion
芹菜素抑制肿瘤生长
芹菜素在体内对肿瘤生长有明显抑制作用。与对照组相比,肿瘤体积减少了50.49%,重量减少了50.63%。芹菜素对小鼠体重无明显影响。H&E染色结果显示,对照组肿瘤组织致密,间质未见新生血管。芹菜素组处理组肿瘤组织质地较为疏松,可见凋亡细胞。肿瘤组织内有少量炎细胞浸润,间质内无新生血管。肿瘤组织坏死面积增大,有中心区坏死,坏死面积大于肿瘤总面积的1/2,坏死区内可见炎细胞浸润。
图1芹菜素对Ishikawa移植瘤生长的抑制作用
芹菜素诱导Ishikawa细胞铁死亡
为了探究芹菜素是否会引起Ishikawa细胞铁死亡,作者加入了铁死亡的抑制剂Fer-1进行集落实验,结果显示,与未处理组相比,芹菜素处理组明显抑制了集落形成率。为了进一步验证芹菜素对Ishikawa细胞铁死亡的影响,作者测定了Ishikawa细胞中铁离子、GSH和MDA的含量。结果表明,芹菜素增加了铁离子,降低了GSH的含量,增加了MDA的含量。这些结果表明,芹菜素能促进Ishikawa细胞铁死亡。
图2芹菜素对铁死亡的影响
芹菜素诱导Ishikawa细胞自噬
为了研究芹菜素是否能够诱导细胞自噬,作者加入了自噬抑制剂CQ进行集落实验。与单独使用芹菜素组相比,CQ和芹菜素组的集落形成率增加。作者进一步在基因和蛋白质水平验证了芹菜素是否能促进Ishikawa细胞自噬。在体外,mRNA和蛋白的表达趋势相同,均表现为AMPK、mTOR、P70S6K、ATG4表达下调,ULK1、Beclin1、LC3B、ATG5、ATG13表达上调。加入自噬抑制剂CQ后,芹菜素对石川细胞蛋白的调节作用减弱。与芹菜素组比较,芹菜素和CQ组AMPK、mTOR、P70S6K、ATG4蛋白水平上调,ULK1、Beclin1、ATG5、LC3B蛋白水平下调。在体内条件下,基因和蛋白质也发生了相同的变化。
图3芹菜素对自噬的影响
对其他器官的影响
为了探讨芹菜素对小鼠其他器官的毒性作用,作者在小鼠模型上进行了病理分析。芹菜素对心、肝、脾、肺、肾无明显影响。肝脏小叶结构正常,肝细胞无退行性变,无坏死,肝窦无充血。心脏心肌细胞结构正常,界限不清,心肌轻度变形。心脏组织间质未见充血水肿,偶见炎性细胞浸润。肾脏方面,肾小球结构良好,大小正常,小管未肿胀,间质未水肿,无局部充血。肺方面,小鼠肺组织的肺泡壁结构和支气管结构完好,支气管上皮细胞无脱落,腔内无分泌物,肺泡壁无增厚。脾脏包膜结构完整、光滑。
图5心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的H&E染色代表性结果
芹菜素可能引起Ishikawa细胞铁死亡和自噬的机制
图6芹菜素引起Ishikawa细胞铁死亡和自噬的可能机制示意图
Conclusion
芹菜素可通过上调ULK1、Beclin1、LC3B、ATG5、ATG13等蛋白表达,下调mTOR、P70S6K、ATG4等蛋白表达,促进Ishikawa细胞自噬。此外,芹菜素处理增加了铁离子浓度,降低了GSH含量,增加了MDA含量。芹菜素还能提高Ishikawa细胞中P62、HMOX1、铁蛋白的蛋白表达,降低SLC7A11、GPX4的蛋白表达,诱导Ishikawa细胞铁死亡。在体内,芹菜素通过自噬和铁死亡抑制肿瘤生长,对小鼠的心、肝、脾、肺、肾的正常生理功能和体重均无影响。结果表明,芹菜素是一种低毒高效的抗癌药物。
作者简介
第一作者
通信作者
YancuiLianga,QianZhonga,b,RunhuiMaa,b,ZhijingNia,b,KiranThakura,b,JianguoZhanga,b,ZhaojunWeia,b,*
aSchoolofFoodandBiologicalEngineering,HefeiUniversityofTechnology,Hefei230009,China
bSchoolofBiologicalScienceandEngineering,CollaborativeInnovationCenterforFoodProductionandSafety,NorthMinzuUniversity,Yinchuan750021,China
*Correspondingauthor.
Apigenin,anaturalflavonoidhasbeenreportedagainstavarietyofcancertypes.However,itisunclearwhetherapigenincanpromoteautophagyandferroptosisinIshikawacells.TherearefewreportsonthemechanismofapigeninonautophagyandferroptosisofendometrialcancerIshikawacells.Wefoundthatironaccumulation,lipidperoxidation,glutathioneconsumption,p62,HMOX1,andferritinwereincreased,while,solutecarrierfamily7member11andglutathioneperoxidase4weredecreased.Ferrostatin-1,aniron-deathinhibitorcouldreversetheeffectsofapigenininIshikawacells.Ontheotherhand,apigenincouldpromoteautophagyviaup-regulatingBeclin1,ULK1,ATG5,ATG13,andLC3Banddown-regulatingAMPK,mTOR,P70S6K,andATG4.Furthermore,apigenincouldinhibittumortissueproliferationandrestricttumorgrowthviaferroptosisinvivo.