活体动物体内生物发光和荧光成像技术基础原理与应用简介
一、活体生物发光成像技术
二、活体动物荧光成像技术
三、生物发光成像与荧光成像的比较
四、活体动物可见光成像仪器原理与操作流程
（一）技术原理
1.标记原理
除FireflyLuciferase外，有时也会用到RenillaLuciferase。二者的底物不一样，前者的底物是荧光素（D-luciferin），后者的底物是coelentarizine。二者的发光波长不一样，前者所发的光波长在540~600nm，后者所发的光波长在460~540nm左右。前者所发的光更容易透过组织，后者在体内的代谢比前者快，而且特异性没有前者好，所以大部分活体实验使用FireflyLuciferase作为报告基因，如果需要双标记，也可采用后者作为备选方案。
荧光素酶的发光是生物发光，不需要激发光，但需要底物荧光素。荧光素在氧气、ATP存在的条件下和荧光素酶发生反应，生成氧化荧光素(oxyluciferin)，并产生发光现象。
对于细菌标记，一般利用发光酶基因操纵子luxABCDE或luxCDABE，其由控制的编码荧光素酶的基因和编码荧光素酶底物合成酶的基因组成。利用这种办法进行标记的细菌会持续发光，不需要外源性底物。但是一般细菌标记需要转座子的帮助把外源基因插入到细菌染色体内稳定表达。
2.底物荧光素的特点
荧光素由于诸多优点得到广大科研人员的青睐，主要特点如下：
(1)荧光素不会影响动物的正常生理功能。
(2)荧光素是280道尔顿的小分子，水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透细胞膜和血脑屏障。
3.光学原理
光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，光子遇到细胞膜和细胞质时会发生折射现象，而且不同类型的细胞和组织吸收光子的特性并不一样。血红蛋白（hemoglobin）是造成体内可见光被吸收的主要因素，其吸收可见光中蓝绿光波段的大部分。但是在可见光大于600纳米的红光波段，血红蛋白的吸收作用却很小。因此，在偏红光区域,大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到。利用活体动物生物发光成像技术最少可以检测到皮下的几百个细胞。当然，由于发光源在老鼠体内深度的不同可看到的最少细胞数是不同的。一般认为，每一厘米深度，发光强度衰减10倍，血液丰富的组织或器官（比如心脏、肝脏、肺脏）衰减多，与骨骼相邻的组织或器官衰减少。在相同的深度情况下，检测到的发光强度和细胞的数量具有非常好的线性关系，可由仪器量化检测到的光强度，反映出细胞的数量。
（二）活体生物发光成像技术应用领域
活体生物发光成像技术是一项在某些领域有不可替代优势的技术，比如肿瘤转移研究、药物开发、基因治疗、干细胞示踪等方面。
1．肿瘤学
活体生物发光成像技术能够让研究人员能够直接快速的测量各种癌症模型中肿瘤的生长、转移以及对药物的反应。其特点是极高的灵敏度使微小的肿瘤病灶（少到几百个细胞）也可以被检测到，比传统方法的灵敏度大大提高了；非常适合于肿瘤体内生长的定量分析；避免由于宰杀老鼠而造成的组间差异；节省动物成本。由于以上特点，使基于转移模型、原位模型、自发肿瘤模型等方面的肿瘤学研究得到发展。建立肿瘤转移模型，可以观察肿瘤转移情况，进一步探讨肿瘤转移的机制；可进行原位接种，观察原位以及原位转移模型，使肿瘤学研究更接近肿瘤临床发病的微观环境；通过建立自发肿瘤模型，可以观察肿瘤发生机理。（图11-1）。
图11-1肿瘤的长期检测，左图分别是7天，14天，30天成像。来自中国军事医学科学院
2．药物研究
在药剂学研究方面，可以通过把荧光素酶报告基因的质粒直接装载在药物载体中，观察药物载体的靶向脏器与体内分布规律（图11-2）。在药理学方面，还可以通过转基因小鼠的应用，观察药物作用的通路，用荧光素酶基因标记某一个兴趣基因，观察药物作用的通路。
图11-2利用IL-1Β转基因小鼠筛选抗炎症药物，来自上海南方模式生物研究中心
3．基因治疗
4．干细胞及免疫学
用荧光素酶标记干细胞有以下几种方法：一种是标记组成性表达的基因，做成转基因动物，干细胞就被标记了，若干细胞移植到另外动物体内，可以用活体生物发光成像技术示踪干细胞在体内的增殖、分化及迁徙的过程；另外一种方法是用慢病毒直接标记干细胞后，移植到体内观测其增殖、分化及迁徙过程，研究其修复、治疗损伤或缺陷部分的效果，进一步探讨其机制。
可以通过标记免疫细胞，观察免疫细胞对肿瘤细胞等的识别和杀死功能，评价免疫细胞的免疫特异性、增殖、迁移及功能等；通过标记异体细胞，观察异体细胞对器官移植影响；也可进行一些关于免疫因子的研究等。
5．基因表达模式与基因功能研究
6．蛋白质相互作用
可利用动物体内生物发光成像技术研究活体动物体内蛋白与蛋白的相互作用。其原理是将分开时都不单独发光的荧光酶的C端和N端分别连接在两个不同的蛋白质上，若是这两个蛋白质之间有相互作用，荧光酶的C端和N端就会被连接到一起，激活荧光素酶的转录表达，在有底物存在时出现生物发光。在活体条件下研究药物对蛋白质相互作用的影响，可以观察到在体外实验中无法模拟的活体环境对蛋白质相互作用的影响。
7．细胞凋亡
利用活体动物生物发光成像技术，直接观察活体动物体内的细胞凋亡。具体原理是用分子生物学方法在荧光酶的两端连接上抑制其发光的蛋白(如雌激素)，但在其连接处加上caspase(细胞凋亡时特异表达的一种酶)的酶切点。细胞发生凋亡时，表达caspase，切开抑制荧光酶发光的蛋白，使荧光素酶开始发光。
8.疾病机理
9．其他
如RNAi、蛋白质核运输等。在荧光素酶基因的一端接要研究的蛋白质的基因，另一端接肯定在细胞核内表达的蛋白的基因，当核外的蛋白运输到核内时，就会导致荧光素酶N端、C端靠近，恢复发光。
1．标记原理
活体荧光成像技术主要有三种标记方法。
（1）荧光蛋白标记：荧光蛋白适用于标记细胞、病毒、基因等，通常使用的是GFP、EGFP、RFP（DsRed）等；
（2）荧光染料标记：荧光染料标记和体外标记方法相同，常用的有Cy3、Cy5、Cy5.5及Cy7，可以标记抗体、多肽、小分子药物等；
2．光学原理
荧光发光是通过激发光激发荧光基团到达高能量状态，而后产生发射光。同生物发光在动物体内的穿透性相似，红光的穿透性在小动物体内比蓝绿光的穿透性要好得多，随着发光信号在体内深度的增加，波长越接近900nm的光线穿透能力越强，同时可消减背景噪音的干扰，近红外荧光为观测生理指标的最佳选择。在实验条件允许的条件下，应尽量选择发射波长较长的荧光蛋白或染料。
（二）活体动物荧光成像技术应用领域
（1）GFP标记的肺肿瘤模型（H-460-GFP）
H-460-GFP是一个绿色荧光蛋白表达细胞系，它起源于H-460肺小细胞肺癌，稳定转染了绿色荧光蛋白基因，并由SV-40启动子起始基因的表达。
通过H-460-GFP皮下肿瘤模型，建立小鼠肺癌的实验模型，可用来进行有关抗癌药物的筛选（图11-3）。可用于测量皮下肿瘤的生长和监测对潜在化学治疗药物的反应。
图11-3左图是接种后1w荧光成像，右图是3w荧光成像（上海市肿瘤研究所供图）
（2）量子点标记细胞系
通过量子点可以标记肿瘤细胞，用量子点Qtracker705对MDA-MB-231乳腺癌细胞进行标记，皮下接种后动态观察其生长以及变化（图11-4）。激发光波长625nm，散射光波长680nm。
2．抗体
分子探针的一端联有能够和生物体内特异靶点结合的分子结构（如肽类、酶的底物、配体等），另一端则是荧光染料。通过Cy5.5标记的抗体的体内代谢实验，可见肝、肾等处的分布（图11-5）。
图11-5Cy5.5标记的抗体的体内代谢实验（上海市肿瘤研究所供图）
3．药学研究
荧光成像在药物制剂学研究，尤其是药物靶向性研究，药物载体研究中有巨大优势。有关专家正在设计用合适的荧光染料标记小分子药物，观察药物在动物体内的特异性分布和代谢情况，尤其是中药研究方面。
图11-6NIR标记的β淀粉酶成像
4．组织工程
通过发展EGFP基因表达的细胞系无创伤的评价组织工程的构建。通过EGFP标记的组织工程细胞移植到小鼠体内特制的支架上，观察该细胞的生长和变化，从而判断组织工程的成败与否。
（一）生物发光成像技术优点
与荧光成像技术相比较，生物发光成像技术主要的优势有：
1．特异性强，无自发荧光
以荧光素酶作为体内报告源的生物发光方法，是以酶和底物的特异作用而发光，特异性极强。动物本身没有任何自发光，使得生物发光具有极低的背景，极高的信噪比。但用荧光方法时，在受到激发光激发时，生物体中皮肤、毛发和各种组织及食物等都会产生荧光，特别是被标记的靶点深臧于组织内部，需要较高能量的激发光时，也就会产生很强的背景噪音。虽然荧光信号强度远远超过生物发光，但极低的自发光水平使得生物发光的信噪比远高于荧光。
2．高灵敏度
生物体内很多物质在受到激发光激发后，也会发出荧光，产生的非特异性荧光会影响到检测灵敏度。特别是当发光细胞深藏于组织内部，则需要较高能量的激发光源，也就会产生很强的背景噪音。荧光成像的灵敏度最高也只能在动物体内检测到约105细胞，相对于生物发光在动物体内监测到102数量级细胞的灵敏度要相差很多。
3.检测的深度
由于生物发光的灵敏度高于荧光成像，对于需要深部成像的研究（检测的深度在3~4cm），如干细胞、原位肿瘤与转移，自发肿瘤等，应用生物发光成像是最佳的选择。
4.精确定量
（二）荧光成像技术优点
在活体动物可见光成像技术中，相对于生物发光成像技术，荧光成像技术的优势主要表现在：
1.荧光染料、蛋白标记能力强
荧光标记物种类繁多，包括荧光蛋白、荧光分子、量子点等，可以与基因、多肽、抗体等生物分子标记，作为分子探针使用范围广。同时，不同的荧光蛋白或染料还可对样本进行多重标记，同时成像。检测的波长范围从300~1100nm，某些仪器公司还提供全光谱的滤光片实现几乎所有荧光标记的体内成像。
2.信号强度大
3.实验成本低
相对于活体生物发光成像来说，荧光成像费用低廉，无需注射底物荧光素。荧光发光基团只要在其合适强度的激发光激发下就可以发出定波长的发射光信号，整个反应不需要向动物注射任何昂贵的反应成分，只要保证荧光基团稳定，就可实现随时激发随时发光的效果。
4.活体动物、动物尸体、器官全部可以进行成像
由于荧光是基于物理能量转移原理，对实验样本的生理状态要求较低，可以实现活体、尸体、尸解组织器官样本的光学成像。而对于生物发光，只有在活细胞内才会产生发光现象。
总之，生物发光和荧光技术，如何互为补充，取长补短，分别满足不同的研究领域，将来的发展方向是两种技术并重。对于不同的研究，可根据两者的特点以及实验要求，选择合适的方法（表11-1）。
表11-1生物发光及荧光特点的比较
优点
缺点
生物发光
特异性强，无自发荧光
高灵敏度，在体内可检测到几百个细胞
检测的深度在3-4厘米
精确定量
需要注入荧光素，实验成本高；
细胞或基因需要转基因标记；
有些物质不能用生物发光标记，如抗体、多肽等
很难用于人体。
荧光
荧光染料、蛋白标记能力强，多种蛋白及染料可用于多重标记；
信号强度大，成像速度快；
实验成本低；
活体动物、动物尸体、器官全部可以进行成像；
可衔接体内实验和体外实验，保持研究的连贯性；
未来可能用于人体。
非特异性荧光限制了灵敏度，体内检测最低约105细胞；
检测深度受限制；
较难精确体内定量。
（一）仪器原理
以NightOWLⅡLB983为例，来说明活体动物可见光成像系统的仪器设计原理。整个仪器由CCD配合密闭性非常好的暗箱、荧光配件、麻醉系统和软件组成。CCD镜头位于暗箱的左上方，荧光光源和光路位于右上方，动物平台（可加热，以保持观察实验动物的体温）位于暗箱的下方，麻醉系统通过管道与暗箱连接。
选择适当的CCD镜头，对于体内可见光成像是非常重要的。选用的CCD镜头对于波长450-700nm的光必须具有非常高的灵敏度和量子效率，而且由于需要探测的光源在皮下几厘米处，其噪声信号要尽可能的小。科研人员经过探索发现，背照射背部薄化冷CCD是唯一合适的选择。这种CCD芯片温度可达<-800C，在该温度下，芯片的暗电流和阅读噪音降到几乎可以忽略不计的水平，同时配合密闭性非常好的暗箱，使得该系统检测生物发光和荧光具有无与伦比的灵敏度。CCD由软件控制升降，自动聚焦，可以获得从3.5厘米到25厘米的连续视野。
成像暗箱屏蔽宇宙射线及一切光源，可以使暗箱内部保持完全黑暗，CCD所检测的光线完全由被检动物体内发出，避免外界环境的光污染。
（二）实验操作流程
1.细胞标记或动物标记等
进行生物发光实验，首先根据实验内容的不同，用荧光素酶基因标记肿瘤细胞、干细胞、病毒、药物载体或动物，或者用Lux操纵子标记细菌。用荧光素酶基因标记可通过质粒、慢病毒或逆转录病毒等方法进行。
如果进行荧光实验，就用GFP、EGFP或RFP标记肿瘤细胞、干细胞、病毒或动物等，后者用荧光染料（包括量子点）标记需要检测的物质，如抗体，药物载体等。
2.体外预实验检测
需要检测的细胞、病毒、细菌等标记后，在活体成像前，可以通过多孔板预先检测一下标记是否成功，荧光素酶或荧光蛋白的表达强度等，并据此筛选阳性克隆、绘制标记物的发光梯度曲线等。体外预实验是作为小动物活体成像解决方案中不可缺少的一部分。比如，利用体外预实验初步检测转染荧光素酶的肿瘤细胞发光值，选择转染率相对高且稳定的一批细胞进行体内实验。对于通常进行的细胞检测来说，具体可以通过活体成像仪器检测活细胞的发光强度，也可以通过体外化学发光和荧光检测仪检测细胞裂解液的发光强度。
当用体外化学发光和荧光检测仪时，可以更准确地捕捉到发光值、更稳定的输出发光值。对于生物发光方式而言，实验所需的仪器是微孔板式化学发光检测仪，如BertholdCentroLB960。对于荧光方式而言，实验所需的仪器是微孔板式荧光检测仪，如BertholdTwinkleTMLB970。(图11-7)
图11-7左侧为BertholdCentroLB960，右侧为BertholdTwinkleTMLB970
3.活体成像
首先麻醉实验动物，可采用异氟烷（isoflurane）或克他命/甲苯噻嗪（ketamine/xylazine）混合液麻醉实验动物。如果采用气体麻醉，可先注射底物。气体麻醉的优点是动物可以很快进入麻醉状态，一旦停止麻醉气体供应，动物会在几分钟内苏醒。
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