摘要：目的对2013年武汉市新发生的一例疑似狂犬病死亡病例的脑组织进行病毒分离及鉴定.方法采用直接荧光抗体法(DFA)和ELISA法检测狂犬病病毒(rabiesvirus,RABV)抗原;提取病毒RNA,设计12对引物,分段扩增全基因组,克隆后测序,应用DNAStar软件包中的MegAlign模块对基因所编码的氨基酸进行对位分析;ClustalX1.83软件和GENEDOC软件用于序列比对;MEGA4.1软件以Kimuratwo-parameter模型邻位相连法(Neighbor-Joining,NJ)构建系统进化树(Bootstrap-1000),并与国内外疫苗株及近期湖北省及周边地区分离的代表性街毒株进行同源性分析.结果分离的街毒株13WH10的RABV抗原呈阳性;13WH10街毒株基因组全长11924bp,属基因Ⅰ型狂犬病病毒;13WH10与湖北省及周边街毒株处于同一亚群,与CTN-1疫苗株及东南亚地区的街毒株同源性较高,高于欧美国家疫苗株.结论成功对武汉市2013年新发生的一例疑似狂犬病死亡病例的脑组织进行了病毒分离及鉴定;CTN-1与RABV国内分离株同源性较高,系统进化关系较近,提示采用CTN-1疫苗株生产的狂犬病疫苗可有效预防中国狂犬病的流行.
目的乳酸乳球菌中表达猪圆环病毒2型(porcinecircovirustype2,PCV2)ORF2与猪繁殖及呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)ORF5的嵌合抗原表位.方法按乳酸乳球菌密码子使用偏好设计并合成PCV2ORF2及PRRSVORF5的串联抗原表位基因,插入至乳酸菌表达质粒pNZ8148,构建重组表达质粒,转化乳酸乳球菌NZ9000中,经乳酸菌素(nisin)诱导表达嵌合蛋白,采用Ni-NTA亲和层析纯化,进行12％SDS-PAGE分析.结果重组表达质粒经双酶切鉴定,构建正确.嵌合蛋白相对分子质量约25000,在乳酸乳球菌中主要以可溶性形式表达,纯化后纯度达96％以上,浓度约1mg/mL,产量可达60mg/L细菌培养物.结论PCV2ORF2与PRRSVORF5的嵌合抗原表位在乳酸乳球菌中得到高效可溶性表达.
目的分析2017年黑龙江省禽腺病毒4型(fowladenovirus-4,FAdV-4)分离株Hexon基因的遗传特征.方法提取疑似心包积液综合征(hydropericardiumsyndrome,HPS)的病鸡肝脏DNA,以其为模板,经PCR扩增Hexon基因,并进行测序.采用BLAST软件对Hexon基因序列进行数据库比对;采用MegAlign软件进行核苷酸和氨基酸同源性比对;采用Mega6软件将分离获得的FAdV-4菌株及35个参考FAdV菌株的全长Hexon基因构建系统进化树.结果Hexon基因PCR产物长度为1204bp,将分离株命名为FAdV-4-DQ.与其他8个FAdV分离株核苷酸和氨基酸的同源性分别为34.6％～98.7％和22.0％～95.7％,其中与中国2015年FAdV-4HNHB分离株及2016年FAdV-4HN151025分离株的核苷酸和氨基酸的同源性较高,分别为98.7％、95.7％和98.6％、95.2％;其次是与印度2008年的FAdV-4PJ-06分离株的核苷酸和氨基酸的同源性较高,分别为98.2％和94.4％.基因进化树分析显示,FAdV-4-DQ株与中国2015及2016年的15个分离株基因型属于同一个进化分枝,并由同一祖先进化.结论本研究获得的FAdV分离株属血清型FAdV-4型,FAdV-C种,与中国2015及2016年流行毒株同属一个基因簇,并推测该分离株起源于印度早期菌株.
目的制备鲍曼不动杆菌OmpK/Omp22融合蛋白,并检测其抗原特异性抗体应答水平.方法以鲍曼不动杆菌标准株19606基因组DNA为模板,通过重叠延伸PCR技术获取OmpK/Omp22融合基因片段,将其定向克隆入原核表达质粒pColdI,筛选重组质粒并进行酶切及DNA测序鉴定.重组质粒转化大肠埃希菌BL21株,经IPTG诱导表达,镍亲和纯化柱纯化重组蛋白.小鼠背部皮下注射重组融合蛋白(20μg/只,体积50μL)和等体积完全弗氏佐剂,并于初次免疫后第14和21天相同剂量加强免疫1次,分别于末次免疫后7、21d小鼠内眦取血,测定小鼠血清中抗原特异性抗体滴度.结果PCR扩增获得约1400bp的基因片段,定向克隆筛选到约5800bp的重组质粒,纯化的重组融合蛋白相对分子质量约52000,小鼠血清中检测到特异性IgG抗体,高抗体滴度可达1:102400.结论成功制备了鲍曼不动杆菌OmpK/Omp22融合蛋白,小鼠血清中检测到高滴度特异性IgG抗体,为进一步研究其免疫活性奠定了基础.
目的探讨丝氨酸-苏氨酸激酶11(liverkinaseB1/serine-threoninekinase11,LKB1)基因沉默对人前列腺癌RWPE-1细胞侵袭及迁移能力的影响及其作用机制.方法将质粒LKB1-shRNA1及shNC分别转染至RWPE-1细胞中,同时设空白对照组(未转染),经G418筛选出稳定表达细胞株.RT-PCR及Westernblot法检测RWPE-1细胞中LKB1基因mRNA转录及蛋白表达水平;划痕试验及Transwell小室试验分别检测LKB1基因沉默对RWPE-1细胞迁移及侵袭能力的影响;RT-PCR及Westemblot法检测RWPE-1细胞中转化生长因子-β1(transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)、基质金属蛋白酶-2(matrixmetalloproteinase-2,MMP-2)及MMP-9基因mRNA转录及蛋白的表达水平.结果与shNC组及空白对照组比较,LKB1-shRNA1组RWPE-1细胞中LKB1基因mRNA转录及蛋白表达水平明显降低(P＜0.001);细胞划痕愈合能力及侵袭细胞数明显升高(P＜0.001);TGF-β1、MMP-2及MMP-9基因mRNA转录及蛋白表达水平均明显上升(P＜0.01).结论LKB1基因沉默可显著提高RWPE-1细胞的转移及侵袭能力,可能是通过上调TGF-β1、MMP-2及MMP-9表达水平产生作用的.
目的研究人脐血造血干/祖细胞(HS/PCs-HUCB)对裸鼠的致突变作用.方法取雄性BALB/c裸鼠,随机分为5组:HS/PCs.HUCB高、中、低剂量组及阴性、阳性对照组,HS/PCs-HUCB高、中、低剂量组分别经尾静脉注射1.25×10~9、3.75×10~8和1.25×10~8个细胞/kg,阴性对照组经尾静脉注射含1%人血白蛋白的0.9%NaCl注射液,50ml/kg,阳性对照组经腹腔注射环磷酰胺,50mg/kg,每d给药1次.微核试验连续给药2d,末次给药24h后取骨髓细胞涂片,Giemsa染色,每组裸鼠计数12000个骨髓嗜多染(PCE)中微核细胞数;精子畸形试验连续给药5d.首次给药后第35天取附睾,精子滴片,伊红染色.每组裸鼠计数1500个精子的形态.结果HS/PCs-HUCB各剂量组裸鼠的微核率和精子畸形率与阴性对照组比较,差异均无统计学意义,各组间精子畸形类型构成比差异无统计学意义,畸形精子以无定形为主,其次为无钩、双头、双尾、双体、胖头等;而l;II性对照组的微核率和精子畸形率均显著高于阴性对照组.结论HS/PCs-HUCB对裸鼠无致突变作用.
目的构建结核分枝杆菌PPE68基因和小鼠胞内病原体抗性基因1(Intracellularpathogenresistance1,Ipr1)的真核共表达质粒,并在小鼠巨噬细胞BAW264.7中表达.方法将结核分枝杆菌PPE68基因和小鼠Ipr1基因分别亚克隆至含多启动子的共表达载体pBudCE4.1中,构建真核共表达质粒pBud68-Ipr1,转染RAW264.7细胞,通过RT-PCR及Westernblot法检测PPE68和Ipr1基因的转录和表达.结果重组表达质粒pBud68-Ipr1经PCR、双酶切及测序证实,插入的PPE68和Ipr1基因片段序列正确;质粒转染RAW264.7细胞后,PPE68和Ipr1基因进行了转录和表达,基因编码产物相对分子质量分别为37000和50000.结论已成功构建了真核共表达质粒pBud68-Ipr1,并在RAW264.7细胞中获得表达,为PPE68/Ipr1重组BCG的构建及其免疫保护作用的进一步研究奠定了基础.
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