何晓旭1,2，刘克明2，汪笑宇2，郝爽2，贾磊2，邵蓬1，罗璋1,2*
(1.天津农学院水产学院，天津300384；2.天津市水产研究所，天津300221)
摘要:为研究半滑舌鳎CynoglossusemilaevisGünther套肠症的病原，于2020年9月从天津市滨海新区某养殖车间采集患病鱼10尾(体长10～15cm)，利用寄生虫检查、病原菌分离、组织病理切片、人工感染试验、生理生化试验、16SrDNA基因序列分析和药物敏感性试验等方法对患病鱼及病原进行了研究。结果表明：患病鱼体表未发现大量寄生虫，脾脏中存在大量结节，肠黏膜组织和肠绒毛腐烂脱落，从肾脏中分离到的优势菌株ST-2020-2能引起健康半滑舌鳎发病，造成90%的死亡率；综合生理生化特征和16SrDNA基因序列分析结果，将其鉴定为美人鱼发光杆菌杀鱼亚种Photobacteriumdamselaesubsp.piscicida；药敏试验显示，菌株ST-2020-2对链霉素、环丙沙星、氟苯尼考敏感，对四环素、卡那霉素、氨苄西林中度敏感，对新霉素、多黏菌素、复方新诺明等10种药物具有耐药性。研究表明，美人鱼发光杆菌杀鱼亚种是半滑舌鳎套肠症的病原，这为该病的防控提供了基础数据。
关键词:半滑舌鳎；肠套叠；美人鱼发光杆菌杀鱼亚种
半滑舌鳎CynoglossussemilaevisGünther隶属于鲽形目Pleuronectiformes舌鳎科Cynoglossidae舌鳎属Cynoglossus，是一种暖温性近海底层鱼类，其味道鲜美、肉质细嫩、营养丰富，深受消费者青睐。随着人们生活水平的提高，对半滑舌鳎的需求量不断增大，推动了半滑舌鳎养殖业的迅速发展。目前，半滑舌鳎已成为中国北方沿海地区重要的海水工厂化养殖品种，2018年产量达1.2万t[1]。但是，随着养殖规模不断扩大，病害也日趋严重，病害已经成为半滑舌鳎养殖业的重大威胁。多种细菌性病原，包括溶藻弧菌[2]、哈维氏弧菌[3]、海藻希瓦氏菌[4]、海分枝杆菌[5]、美人鱼发光杆菌[6-7]等被报道。此外，也发现了病毒性病原[8]。
2020年9月，天津市滨海新区某半滑舌鳎养殖场发生病害，发病速度慢，发病20d后累计死亡率为15%。患病鱼表现除反应迟钝、离群独游外，显著的特征为脱肛，肠套叠。为了探明其病因，从患病鱼肾脏分离到一株疑似病原，本研究中采用组织病理学、生理生化反应及分子生物学等方法对病原进行了鉴定，并筛选出敏感性药物，这是半滑舌鳎肠套叠症状的首次报道，以期为今后该病的有效防控提供技术支撑。
试验鱼：体长10～15cm的患病半滑舌鳎从天津市滨海新区的某海水养殖场收集，将濒死的鱼装入氧气袋后被快速送往实验室进行诊断和病原分离；体长8～10cm的健康半滑舌鳎由天津市天世农海水养殖有限公司提供，无发病史。
主要试剂：脑心浸液培养基(BHI)购自英国Oxoid公司，药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司，DNA分子Marker和2×TaqMasterMix购自宝生物工程(大连)有限公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.2.1病原的分离用75%乙醇(体积分数，下同)棉球反复擦拭病鱼体表后，在无菌操作台中对病鱼进行解剖，用接种环分别从患病鱼的肾和脾中取少量样品划线接种于脑心浸液培养基(BHI)和血平板，于28℃下培育48h后进行观察，选取优势菌的单菌落进一步划线纯化，得到优势菌株并命名为ST-2020-2。取患病鱼的鳍条、鳃、黏液等样品在显微镜下进行寄生虫检查。
1.2.2组织病理切片观察取患病鱼肠、肝、肾、脾等组织，用中性甲醛固定，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，切成5μm厚度，然后进行苏木精伊红染色(H.E)，同时取正常鱼组织作为对照。
1.2.3人工感染试验将菌株ST-2020-2划线接种于BHI平板，于28℃下培养24h后，挑取单菌落接种于BHI液体培养基中。28℃、150r/min振荡培养24h后，以6000g离心10min后收集细菌，利用无菌PBS将细菌浓度调整至1.2×107cfu/mL。将60尾健康的半滑舌鳎随机分为2组(每组30尾)，试验组每尾鱼腹腔注射0.1mL菌悬液，对照组每尾鱼注射0.1mL无菌PBS。试验鱼在22℃循环水养殖系统中养殖14d，每天观察试验鱼的发病和死亡情况，统计死亡数，濒死的鱼进行病原菌分离和鉴定。
1.2.4病原的生理生化特性测试将菌株ST-2020-2接种于BHI和血平板进行菌落形态观察，按照东秀珠等[9]的方法对分离菌株进行生理生化测试，包括革兰氏染色、运动性、37℃生长、溶血性、氧化酶反应和葡萄糖发酵等。
1.2.6药物敏感性试验采用K-B药敏纸片法测定菌株ST-2020-2的药物敏感性[11]。将0.1mL108cfu/mLST-2020-2菌悬液涂布于BHI平板，然后将氨苄西林(10μg)、链霉素(10μg)、四环素(30μg)等16种药敏纸片黏贴在平板上，28℃下培养18～24h后测定抑菌圈直径,按产品说明书判定对药物的敏感度。
患病鱼主要症状表现为食欲下降、游泳异常，离群后游至水体表层，对外界反应迟钝。体表黏液增多，鳍条充血，腹部膨胀，脱肛(图1A)，腹腔内有大量积水，部分鱼肠道充血(图1B)，肠道套叠明显(图1C)，10尾患病鱼共检查到8尾有肠套叠现象。
A—脱肛，鳍条基部出血；B—肠道充血；C—肠套叠。A—rectalprolapseandhyperemiaatthebaseofthefins；B—hyperemiainintestinaltract；C—intussusception.图1患病半滑舌鳎的典型症状Fig.1Typicalsymptomofhalf-smoothtonguesolewithintussusceptiondisease
通过病理切片观察发现，患病半滑舌鳎脾脏中部分细胞坏死，并出现大量空泡，此外，发现大量直径约为30μm的小型结节(图2B)；肾脏中白细胞增多，肾小管上皮细胞坏死、解体(图2D)；肠道肌肉层松弛，肌肉层和黏膜层中有大量的红细胞聚集，肠绒毛和肠黏膜组织腐烂并脱落(图2F)。
A—正常脾脏组织；B—患病脾脏，部分细胞坏死，出现大量空泡，含有大量小型结节(★所示)；C—正常肾脏组织；D—患病肾脏，白细胞增多，肾小管上皮细胞坏死、解体(★所示)；E—正常肠道组织；F—患病肠道，肌肉层和黏膜层中有大量的红细胞聚集(★所示)，肠绒毛和肠黏膜组织腐烂脱落。A—normalspleenappearance;B—diseasedspleen,showingnumerousnecroticcellsandabundantnodules(stars);C—normalkidneyappearance;D—diseasedkidney,showingvacuolardegenerationandnecrosisofepithelialcellsofrenaltubule(stars);E—normalintestinaltract;F—diseasedintestinaltract,showingintestinalvilliandmucosaltissuelargelyrottedandseparatedfromtheliningoftheintestine,andredbloodcellaccumulationinthemusclelayerandmucouslayer(stars).图2患病半滑舌鳎组织病理变化Fig.2Histopathologicalchangesofdiseasedhalf-smoothtonguesole
利用显微镜进行寄生虫检测，除体表黏液和鳃丝有少量纤毛虫外，其他部位未检测到寄生虫。从肾脏中分离到一株细菌，将其命名为ST-2020-2。将该菌在BHI平板上28℃下培养48h后，菌落呈圆形、湿润、扁平、光滑、淡黄色、不透明、边缘整齐，菌落直径为1.5～2.0mm，在TCBS培养基上不生长。
通过生理生化试验发现，菌株ST-2020-2为革兰氏阴性杆菌，无运动性，不溶血，37℃不生长，氧化酶和VP反应阳性，能利用葡萄糖，不能利用蔗糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露醇、蜜二糖(表1)。
图3基于邻接法构建的不同物种16SrDNA系统进化树Fig.3Phylogenetictreeofthe16SrDNAsequencesindifferentspeciesbasedonNeighbor-joiningmethod
从人工感染后的第3天开始，半滑舌鳎开始出现死亡，至第14天时，试验组半滑舌鳎的累计死亡率为90%，对照组在第2天时有1尾死亡，可能是人为操作不慎造成，累计死亡率为3.33%(图4)。死亡鱼的主要症状为腹部膨胀，腹水。从濒死半滑舌鳎肾脏和脾脏分离细菌，发现菌落形态单一，随机挑取单菌落进行纯化，命名为ST-2020-3，其生理生化反应结果与菌株ST-2020-2完全一致(表1)。
图4人工感染半滑舌鳎的累计死亡率Fig.4Cumulativemortalitiesofexperimentallyinfectedhalf-smoothtonguesole
表1菌株ST-2020-2和ST-2020-3的生理生化反应结果Tab.1PhysiologicalandbiochemicalidentificationofisolatedstrainsST-2020-2andST-2020-3
生化项目biochemicalitemST-2020-2ST-2020-3革兰氏染色gramstain--运动性motility--37℃生长growthat37℃--氧化酶oxidase++VP反应Voges-Proskauerreaction++吲哚产生indoleproduction--H2S产生H2Sproduction--柠檬酸盐citrateutilization--溶血性hemolysisγγ葡萄糖glucose++蔗糖sucrose--阿拉伯糖arabinose--鼠李糖rhamnose--甘露醇mannitol--蜜二糖melibiose--山梨醇sorbitol--
注：+表示阳性；-表示阴性；γ表示γ型溶血。Note:+,positive;-,negative；γ,γhemolysis.
菌株ST-2020-2的药敏试验结果如表2所示，在测定的16种抗生素中，菌株ST-2020-2除了对链霉素、环丙沙星和氟苯尼考敏感外，对四环素、卡那霉素、氨苄西林中度敏感，对新霉素、多黏菌素、复方新诺明等10种药物具有耐药性。
表2菌株ST-2020-2对16种抗生素的敏感性分析Tab.2SensitivityofstrainST-2020-2to16kindsofantibiotics
抗生素antibiotics敏感性sensitivity四环素tetracyclineI新霉素neomycinR链霉素streptomycinS多黏菌素polymyxinBR复方新诺明SMZ-TMPR卡那霉素kanamycinI妥布霉素tobramycinR左氟沙星levofloxacinR氨苄西林ampicillinI诺氟沙星norfloxacinR环丙沙星ciprofloxacinS氟苯尼考florfenicolS万古霉素vancomycinR罗红霉素roxithromycinR磺胺甲基异恶唑sulfamethoxazoleR氧氟沙星ofloxacinR
注：S—敏感；I—中度耐药；R—耐药。Note：S—sensibility；I—moderatedrugresistance；R—drugresistance.
美人鱼发光杆菌包括美人鱼发光杆菌杀鱼亚种Photobacteriumdamselaesubsp.piscicida和美人鱼发光杆菌美人鱼亚种Photobacteriumdamselaesubsp.damselae两个亚种，美人鱼亚种以前被称为美人鱼弧菌，具有弧菌的部分特性，37℃能生长，能感染多种海洋鱼类和人类，引起人类伤口感染和坏死性筋膜炎[11-13]。杀鱼亚种曾被称为杀鱼巴斯德氏菌Pasteurellapiscicida，37℃不能生长，故对人没有致病性[14]，是鱼类巴斯德氏菌病亦称类结节症的病原，对多种养殖鱼类有高致病性，鰤Seriolaquinqueradiata[15]、大黄鱼Pseudosciaenacrocea[16]、龙胆石斑鱼Epinepheluslanceolatus[17]、金头鲷Sparusaurata[18]、军曹鱼Rachycentroncanadum[19]、卵形鲳鲹Trachinotusovatus[20]、豹纹鳃棘鲈Plectropomusleopardus[21]、大菱鲆Scophthalmusmaximus[22]和半滑舌鳎[6]等海水鱼类都能被其感染。美人鱼发光杆菌杀鱼亚种因宿主范围广、死亡率高而被认为是世界范围内海水养殖中最具威胁性的细菌性病原之一，给欧洲、美国、日本和中国等国家和地区的海水养殖业造成了重大经济损失[23]。
本试验中，从患病半滑舌鳎肾脏中分离到大量菌落形态一致的细菌，通过生理生化反应和分子生物学分析，将分离菌株ST-2020-2鉴定为美人鱼发光杆菌杀鱼亚种。通过回感试验，发现该菌株能引起半滑舌鳎发病并导致90%的死亡率，这说明菌株具有较强的致病性，是导致半滑舌鳎套肠症病害的病原。研究表明，美人鱼发光杆菌杀鱼亚种携带溶血素基因，能分泌溶血素，在血平板中呈现α或β溶血[20-21]。溶血素可以溶解动物血液中的红细胞，从而对动物组织造成损伤，是细菌的主要毒力因子之一。本试验中分离的菌株ST-2020-2虽不具备溶血性，但同样能导致半滑舌鳎的发病和死亡，这表明美人鱼发光杆菌杀鱼亚种还存在其他重要的致病因子。此外，本研究中分离到的无溶血性的美人鱼发光杆菌杀鱼亚种是否代表一种新的血清型还有待进一步研究，这为今后该菌血清型的分析提供了材料。
综上所述，本研究中首次报道了半滑舌鳎套肠症，从患病鱼体内分离出疑似病原，经鉴定为美人鱼发光杆菌杀鱼亚种，通过药敏试验筛选了敏感药物，为该病的防治提供了技术支撑。
1)从患套肠症半滑舌鳎体内分离疑似病原，综合生理生化特征和16SrDNA基因序列分析将其鉴定为美人鱼发光杆菌杀鱼亚种，该分离菌株能引起健康半滑舌鳎发病，致死率为90%，说明美人鱼发光杆菌杀鱼亚种是导致半滑舌鳎套肠症病害的病原。
2)分离菌株美人鱼发光杆菌杀鱼亚种对链霉素、环丙沙星、氟苯尼考敏感，对四环素、卡那霉素、氨苄西林中度敏感，对新霉素、多黏菌素、复方新诺明等10种药物具有耐药性，说明分离菌株具有多重耐药。今后应采取多种防控措施，为鱼类养殖业的可持续发展提供技术支撑。
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(1.CollegeofFisheries,TianjinAgriculturalUniversity,Tianjin300384,China;2.TianjinFisheryResearchInstitute,Tianjin300221,China)
Keywords：CynoglossusemilaevisGünther;intussusception;Photobacteriumdamselaesubsp.piscicida
中图分类号：S943
文献标志码：A
DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2021-119
收稿日期：2021-05-24
基金项目：天津市淡水养殖产业技术体系项目(ITTFRS2021000，ITTFRS2021000-008);财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系资助(CARS-47)
作者简介：何晓旭(1994—)，女，硕士研究生。E-mail:1594089671@qq.com
通信作者：罗璋(1982—)，男，高级工程师。E-mail:luozhang2010@163.com