本发明涉及用于治疗、改善某些疾病和病症，如成瘾和强迫性障碍或促进从其恢复的化合物和所述化合物的使用方法。
本申请要求2018年2月9日提交的美国临时专利申请第us62/628,658号的权益；其全文特此以引用的方式并入。
背景技术：
成瘾和强迫性障碍越来越被认为是由其自身因素所致的疾病，并且不仅仅认为是行为。随着这些病症的神经基础变得更好理解，有可能通过药物介入对其进行治疗。但是，这些病症的有效治疗仍然是难以实现和未充分开发的。
伏隔核和腹侧被盖区(vta)被认为是成瘾药物起作用的主要部位。成瘾药物包括海洛因、可卡因、酒精、鸦片剂、尼古丁、安非他明(amphetamine)和其合成类似物。此类药物引起多巴胺对强化信号处理的神经调节性影响的改变，从而使得多巴胺在伏隔核中的作用被延长。此类药物还可刺激伏隔核和/或vta中的神经元。常见滥用药物刺激多巴胺释放，产生其奖励和精神运动效应。由重复多巴胺刺激产生的中脑边缘多巴胺系统的永久功能改变导致强迫性服药特性。回应于药物滥用，分子和细胞适应在vta中且沿中脑边缘多巴胺投射路径造成多巴胺活性敏化。成瘾个体的多巴胺合成酶酪胺酸羟化酶的活性增加，这些神经元对兴奋输入的反应也增加。后一效应次于转录因子creb的活性增加且上调glur1(谷氨酸的ampa受体的一种重要亚单位)。神经处理的这些改变可造成适应性情感信号在决策能力运作中的影响减弱，因为觅药和服药行为变为习惯性和强迫性的。
附图说明
图1：ast-004增加培养的星形胶质细胞中的细胞内ca2+。a)染料负载(cal520)星形胶质细胞中的静止ca2+水平的图像。b)针对图a中的垂线的ca2+荧光的时空图。在2分钟处添加ast-004。应注意，振荡ca2+反应持续超过6分钟。c)指定a3r激动剂浓度下的积分ca2+荧光强度(df/f0)的图。值为平均值+/-sem(资料从各浓度下的3个实验收集)。在尼康(nikon)sweptfield共聚焦显微镜上获取图像。
图2：通过嘌呤能激动剂ast-004增加耗氧率(ocr)。将培养的星形胶质细胞接种于标准seahorse培养皿(24孔)上。在建立基础ocr之后，在第一箭头处添加嘌呤能激动剂ast-004或对照(拮抗剂)。基础呼吸在ast-004处理的孔中显著增加。在第二箭头处添加寡霉素，展现可归于atp生产的ocr的量。如在添加解偶联剂fccp(第3箭头)的情况下所展现，ast-004处理的星形胶质细胞中的最大呼吸显著更高。最终添加线粒体抑制剂揭开非线粒体ocr源。
图3：由ast-004减少且被a3r拮抗剂(mrs1523)阻断的光栓疗法诱导中风梗塞。a)媒剂(盐水注射)和经治疗小鼠，ast-004(0.2mg/kg)中由光栓疗法中风的脑的连续冠状面切片。在中风24小时后处死小鼠，去除其脑，用ttc切片和染色。b)平均ttc染色的中风体积。c)用a3r拮抗剂mrs1523预治疗的小鼠中的中风体积。数据从2个实验收集(平均值+/-sem)。
图4：通过ast-004(ast-004)和mrs2365治疗减少了tbi诱导的gfap表达增加。小鼠经历假手术或tbi(在脑的同一侧上)且接受治疗，在tbi后30分钟标记。在损伤后7天从小鼠获得血浆，接着将其处死以从同侧和对侧半球(中间的三分之一)获得脑匀浆。将蛋白质印迹分析归一化为肌动蛋白。(a和c)对于第7天的同侧大脑匀浆和血浆显示代表性印迹。(b和d)数据从3个不同实验(n＝每次治疗小鼠的数量)汇集并且绘制成条柱频率分布图，展示为对照平均值+/-sem。来自未治疗tbi的*p<0.05并且**p<0.01(暗灰色条柱)。
图5：体内生物发光成像指示ast-004增加atp。a)表达星形胶质细胞中的荧光素酶报导基因(gfap启动子)的转基因小鼠经受钝tbi(密闭式皮质撞击(closedcorticalimpact))。初始创伤之后2至4天，向小鼠腹膜内注射合成d-荧光素类似物(cytluc1，100μl)。在cycluc1注射之后5分钟用ivisspectrumimager记录生物发光信号(绿色箭头)。接着在4分钟处向小鼠腹膜内注射媒剂或ast-004(蓝色箭头)，立即测量光子通量且接着与20分钟处的光子通量(红色箭头)相比。b)直方图展示相比于媒剂，注射ast-004的小鼠展现更高的光子通量水平，与星形胶质细胞中更高的atp产量一致。
图6：在用shrna处理的经培养星形胶质细胞中，glud1表达减少80％。a)获自经受对照(scram)或glud1shrna的星形胶质细胞细胞系(c8d1a)的细胞提取物的蛋白质印迹分析。glud1水平显著降低。为进行比较，也呈现glast、谷胱甘肽合成酶(gs)和肌动蛋白的蛋白质印迹。b)归一化为肌动蛋白的表达水平的直方图。glud1的减少量为大约80％减少。
图7：星形胶质细胞中的glud1敲落(kd)阻断atp中p2y1r和a3r刺激的增加。a、b)细胞在正常葡萄糖培养基(a)或不含葡萄糖的补充有半乳糖(b)的培养基中用p2y1r激动剂mrs2365处理20分钟。半乳糖迫使细胞使用氧化磷酸化进行能量代谢。在以指示浓度的mrs2365进行p2y1r刺激之后，atp水平显著增加，但仅在对照细胞(加扰shrna)中。针对glud1用shrna处理的那些细胞无反应。c)atp水平也随着a3r激动剂ast-004而增加，但在用glud1shrna处理的细胞中不增加。用荧光素-荧光素酶试剂盒测量细胞内atp水平。
图8：ast-004治疗显著减少小鼠中的可卡因自施用。将数据归一化为每只小鼠在基线处的个别可卡因摄入。训练小鼠在2小时日程中以固定比3排程自施用可卡因(0.5mg/kg/输注)。在其摄入稳定(基线)之后，小鼠在第0天植入含有盐水(实心圆)或药物ast-004(空心圆)的渗透小型泵，每组中的n＝5只小鼠。小鼠休息一天(第7天)，接着返回至日程中的自施用。应注意，输注数目在ast-004治疗的小鼠中减少，而盐水治疗的小鼠增加输注。
图9：适用于本发明的某些化合物的结构。此类化合物可用于本文所描述的任何方法。
具体实施方式
可卡因自施用小鼠在大脑的vta(腹侧被盖区)中展现显著较高的谷氨酸水平。vta，尤其是vta多巴胺神经元在奖励系统、动机、认知和药物成瘾中起若干作用，且可为若干精神病症的焦点。升高的谷氨酸水平似乎至少部分归因于谷氨酸吸收至星形胶质细胞中的损失。不希望受理论所束缚，相信降低的谷氨酸可用性对星形胶质细胞功能具有负面影响，且此功能丧失影响神经元活性和觅药行为。现在已发现本文公开的化合物治疗或预防成瘾个体的复发，例如通过逆转此类星形胶质细胞功能丧失。此类星形胶质细胞功能丧失可部分归因于星形胶质细胞中谷氨酸转运体(glt-1)的表达减少。由于星形胶质细胞代谢谷氨酸以产生atp，这可能损害谷氨酸吸收，减弱星形胶质细胞氧化代谢和下游atp依赖性过程并且进而减弱其维持对于vta神经元活性最佳的环境的能力。
在一些实施例中，成瘾是针对具有滥用潜力的物质或药物。在一些实施例中，具有滥用潜力的物质或药物是处方或娱乐性药物。
在一些实施例中，具有滥用潜力的物质或药物选自酒精、尼古丁、兴奋剂、大麻素激动剂或类鸦片激动剂。在一些实施例中，具有滥用潜力的物质或药物选自海洛因、可卡因、酒精、吸入剂、类鸦片、尼古丁、安非他明或其合成类似物、盐、组合物或组合。
在一些实施例中，安非他明选自安非他酮、卡西酮、mdma或甲基安非他明。
在一些实施例中，处方或娱乐性药物选自大麻素激动剂或类鸦片激动剂。
在一些实施例中，成瘾为酒精或尼古丁成瘾。
在一些实施例中，受试者为多药滥用者。
在一些实施例中，处方或娱乐性药物选自可卡因、海洛因、安非他酮、卡西酮、mdma或甲基安非他明吗啡碱、羟考酮、氢吗啡酮、芬太尼或其组合。
在一些实施例中，所公开的化合物增加由星形胶质细胞，如星形胶质细胞线粒体介导的能量代谢。在一些实施例中，化合物逆转由具有滥用潜力的物质引起的谷氨酸吸收至星形胶质细胞中的损失。在一些实施例中，化合物至少部分逆转由成瘾引起的大脑奖励系统的重塑。在一些实施例中，此类效应由大脑或cns腺苷a3受体，如vta中的星形胶质细胞a3r；或微神经胶质细胞a3r介导。
在一些实施例中，所述方法治疗受试者的成瘾或成瘾行为或预防其复发。在一些实施例中，受试者对一或多种成瘾物质，如成瘾药物(具有滥用潜力的药物)成瘾。如下所述，此类药物包括处方药物和娱乐性药物，如海洛因、可卡因、尼古丁或类鸦片激动剂。
在另一方面，本发明提供一种治疗或预防由对一或多种成瘾物质或药物成瘾引起的戒断的方法，所述方法包含向有需要的受试者施用有效量的所公开的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物减少戒断中的成瘾个体的戒断症状。在一些实施例中，化合物治疗戒断的成瘾个体的戒断。在一些实施例中，方法进一步包含共同施用另一治疗戒断的药物和任选地咨询，如精神疗法。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗或预防强迫性性障碍或强迫性行为复发的方法，所述方法包含向有需要的受试者施用有效量的所公开的化合物。
在一些实施例中，强迫性障碍为强迫症(ocd)、妥瑞综合症(tourettesyndrome)、拔毛癖、厌食症、贪食症、焦虑症、精神病或创伤后应激障碍。
根据另一方面，本发明提供一种治疗一或多种行为成瘾和成瘾行为或病症的方法，所述方法包含向有需要的受试者施用所公开的化合物或其药学上可接受的盐。行为成瘾和成瘾症由人们在某些活动期间从脑化学物质(例如血清素、肾上腺素(adrenaline/epinephrine))释放感觉的中毒产生。此类病症为所属领域中已知的且包括赌博、性瘾、色情成瘾、饮食障碍、消费成瘾、愤怒/生气、工作成瘾、运动成瘾、冒险成瘾(例如盗窃癖和放火癖)、完美主义、网络或视频游戏成瘾和强迫性使用电子设备，如文字发送和查看社交媒体(仅列举数例)。
或其药学上可接受的盐。
在另一方面，本发明提供一种治疗由对具有滥用潜力的物质或药物成瘾引起的戒断或促进从其恢复的方法，所述方法包含向有需要的受试者施用有效量的选自以下的化合物：
在一些实施例中，化合物为
在一些实施例中，成瘾是对选自以下的具有滥用潜力的物质或药物：酒精、尼古丁、麻醉剂、处方药物或娱乐性药物。
在一些实施例中，具有滥用潜力的物质或药物选自兴奋剂、抑制剂、大麻素激动剂或类鸦片激动剂。
在一些实施例中，具有滥用潜力的物质或药物选自海洛因、可卡因、酒精、尼古丁、吸入剂(例如支气管扩张剂，如β-激动剂，或皮质类固醇或类固醇)、巴比妥酸盐、苯并二氮呯、处方类鸦片激动剂镇痛剂、尼古丁、安非他明或其类似物、盐、组合物或组合。
在一些实施例中，具有滥用潜力的物质或药物选自酒精、尼古丁、海洛因、可卡因、四氢大麻酚(thc)、异戊巴比妥、阿洛巴比妥、阿普比妥、苯烯比妥、巴比妥、溴烯比妥、戊巴比妥、苯巴比妥、司可巴比妥、甲苯巴比妥、布塔巴比妥、吐诺尔(tuinal)、安定(valium)、阿普唑仑、劳拉西泮、氯硝西泮、唑吡坦、安非他酮、卡西酮、mdma、安非他明、甲基安非他明、右旋苯丙胺、哌醋甲酯、鸦片、吗啡碱、羟考酮、可待因、美沙酮、度冷丁、羟吗啡酮、氢可酮、曲马多、卡芬太尼、氢吗啡酮或芬太尼，或其药学上可接受的盐或类似物；或其组合。
在一些实施例中，受试者具有酒精或尼古丁成瘾。
在一些实施例中，受试者为多药滥用者，例如尼古丁和酒精成瘾或类鸦片和大麻素成瘾。
在一些实施例中，方法至少部分逆转由成瘾引起的谷氨酸吸收至星形胶质细胞中的损失。
在一些实施例中，方法增加由星形胶质细胞、胶质细胞、微神经胶质细胞、神经元、内皮细胞或大脑和/或中枢神经系统(cns)的其它细胞介导的能量代谢。
在一些实施例中，所述方法治疗受试者的成瘾或成瘾行为或预防其复发。
在一些实施例中，化合物减少戒断中的成瘾个体的戒断症状。
在一些实施例中，方法进一步包含共同施用第二药物以治疗戒断。
在一些实施例中，化合物经口、静脉内或非经肠施用。在一些实施例中，受试者是哺乳动物，如人类。在一些实施例中，人类是成年人。
2.定义
除非另外规定，否则如本文所用，术语“成瘾”包括对物质的生理或心理依赖性。当所述物质被戒断时，成瘾可涉及戒断症状或精神或身体痛苦。在一些实施例中，成瘾包括以下中的一或多种：药物喜好、药物依赖性、习惯形成、神经和/或突触改变、罹患大脑奖励系统病症、行为改变或受试者成瘾的其它征象或症状。
如本文所用，术语“成瘾药物”或“具有滥用潜力的药物”包括已知导致成瘾或强迫行为的临床、行为或神经表现的药物和其它物质(如尼古丁)，无论是否被监管机构批准用于治疗疾病。在一些实施例中，成瘾药物包括尼古丁、大麻素激动剂、兴奋剂、抑制剂或类鸦片激动剂。“成瘾物质”是指成瘾药物以及其它滥用物质，如酒精。成瘾物质的实例因此包括海洛因、可卡因、酒精、鸦片剂、尼古丁、吸入剂、巴比妥酸盐、安非他明和其合成类似物。
3.本发明的某些化合物的描述
在一个方面中，本发明提供适用于预防、治疗、改善公开的疾病、病症或病况(如成瘾)或促进从其恢复的化合物。在一些实施例中，化合物增加由星形胶质细胞介导的神经保护和神经再生。在一些实施例中，化合物对于a3受体具有选择性，例如a3受体的选择性相对于其它腺苷受体是至少10倍；或例如相对于其它腺苷受体超过25倍、50倍、100倍、500倍或1000倍。在一些实施例中，化合物选择性调节a3受体。在一些实施例中，化合物是a3受体处的选择性激动剂。在一些实施例中，化合物是a3受体处的选择性部分激动剂。在一些实施例中，化合物是a1和a3受体两者处的双重部分促效剂。在一些实施例中，化合物是偏置的完整或部分激动剂。在一些实施例中，化合物是偏置的完整或部分拮抗剂。
在一些实施例中，化合物对于p2y1受体具有选择性，例如p2y1受体的选择性相对于其它p2y受体是至少10倍；或例如相对于其它p2y受体超过25倍、50倍、100倍、500倍或1000倍。在一些实施例中，化合物选择性调节p2y1受体。在一些实施例中，化合物是p2y1受体处的选择性激动剂。在一些实施例中，化合物是p2y1受体处的选择性部分激动剂。在一些实施例中，化合物是偏置的完整或部分激动剂。在一些实施例中，化合物是偏置的完整或部分拮抗剂。
术语“偏置”是指优选地调节、活化、激动或拮抗一或多种但非全部的与受体有关的路径的化合物。
不希望受理论所束缚，人们相信偏置的完整或部分激动作用或拮抗作用使得选择性调节一或多种与a3或p2y1受体有关联的路径，这可导致改善治疗疾病或病况并且避免非所需路径调节(其将导致副作用)。在一些实施例中，选择性调节优先活化如本文所公开的星形胶质细胞。因此，在一些实施例中，所公开的化合物是连接至腺苷a3受体或p2y1受体的一或多个g偶联或g独立路径的偏置完整或部分激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，化合物选择性调节由a3或p2y1受体介导的路径，如β-抑制蛋白活化、细胞内钙移动、camp调节、atp依赖性钾通道活化、或erk1/2磷酸化或与这类路径有关的其它下游细胞活动。在一些实施例中，所述路径增加或有关于神经保护或神经修复。在一些实施例中，化合物选自(n)-甲醇碳核苷，如ast-004；或其药学上可接受的盐。
如本文所用的术语“甲醇碳核苷”是指核苷类似物，其中存在于核糖的四氢呋喃环中的氧被亚甲基单元置换，并且所得碳环与环丙基环稠合以形成双环[3.1.0]己烷，如结构不受理论束缚，相信甲醇碳核苷模拟糖构象或类构象，其被认为受到某些受体亚型青睐。在一些实施例中，北甲醇碳核苷是模拟或偏好c3′-内/c2′-外糖构象的核苷，并且南甲醇碳核苷是模拟或偏好c3′-外/c2′-内构象的核苷。在一些实施例中，(n)-甲醇碳(“北”甲醇碳)糖具有以下结构：在一些实施例中，(n)-甲醇碳糖具有以下结构：在本文中称为“d-(n)-甲醇碳糖”。在其它实施例中，甲醇碳糖呈南或(s)-甲醇碳构形。在一些实施例中，这类甲醇碳糖由以下结构表示：在一些实施例中，(s)-甲醇碳糖具有以下结构：在本文中称为“d-(s)-甲醇碳糖”。
已出人意料地发现，某些嘌呤核苷单、二和三磷酸盐，如本文中详细描述的那些，可能通过外核苷酸酶(负责在细胞膜的两个表面上存在的核苷酸的去磷酸化并且在血液和血浆中循环的酶)在活体内快速去磷酸化(参见吉甘辛(ziganshin)等人欧洲生理学杂志(pflugersarch.)(1995)429:412-418)。通常极其难以预测哪些核苷酸类似物将是外核苷酸酶的底物，并且将因此被期望在体内去磷酸化。在一些实施例中，去磷酸化的化合物负责疗效。因此，在一些实施例中，对应的磷酸化单、二、或三磷酸盐或磷酸酯，如其烷基或苯基酯，是负责治疗效果的试剂的前药或前体。
在一些实施例中，本发明的化合物能够穿过血-脑屏障(blood-brainbarrier，bbb)。如本文所用，术语“血-脑屏障”或“bbb”是指bbb本身以及血液-脊椎屏障。由脑血管、基底膜和神经胶质细胞的内皮组成的血-脑屏障用以限制物质渗透到脑中。在一些实施例中，在向患者施用(例如经口或静脉内施用)之后，总药物的脑/血浆比是至少大约0.01。在一些实施例中，总药物的脑/血浆比是至少大约0.03。在一些实施例中，总药物的脑/血浆比是至少大约0.06。在一些实施例中，总药物的脑/血浆比是至少大约0.1。在一些实施例中，总药物的脑/血浆比是至少大约0.2。
因此，在一些实施例中，化合物的clogp为小于约0.8、约0.7、约0.6、约0.5、约0.4、约0.3、约0.2、约0.1、约0.05、约0.01或约0.005。在一些实施例中，化合物的clogp为小于约0，如小于约-0.1、-0.2、-0.3、-0.4、-0.5、-0.6、-0.7、-0.8或-0.9或更小。在一些实施例中，化合物具有约0.5至0.9的血浆中的未结合部分。在一些实施例中，化合物具有约0.6至0.85、0.7至0.8、或约0.75的血浆中的未结合部分。在一些实施例中，化合物具有至少约0.02，或至少约0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.12、0.15或0.17或更大的脑中的未结合部分。在一些实施例中，化合物具有约0.6至0.85、0.7至0.8、或约0.75的血浆中的未结合部分和/或至少0.08的脑中的未结合部分。
本发明的化合物可使用所属领域中已知的方法、使用不超过常规实验制备。举例来说，某些本发明化合物可遵循美国专利第7,087,589号(和其中引用的参考文献)中提供的程序制备，所述专利特此以引用的方式并入。
在一些实施例中，2-甲硫基-adp或其药学上可接受的盐适用于本发明的方法。不希望受理论所束缚，人们相信2-mesadp在活体内快速水解成2-甲硫基腺苷，其中其为a3r的偏置激动剂、部分激动剂或偏置部分激动剂。2-甲硫基腺苷被认为具有与ast-004非常类似的受体结合。
也包括a3r变构调节因子，其在天然配体存在下增强受体活性，所述配体如2-环己基-n-(3,4-二氯苯基)-1h-咪唑[4,5-c]喹啉-4-胺(也称为cf602，can-fite)。然而，决不排除以上列举的a3r激动剂，并且还可使用其它这类激动剂。也涵盖施用共价结合到聚合物的a3r激动剂。举例来说，a3r可呈共轭物形式施用，其中激动剂结合到聚酰胺基胺(pamam)树枝状聚合物。
不希望受理论所束缚，人们相信通过某些尿苷类似物的完整或部分激动作用,包括偏置激动作用将允许选择性调节一或多种路径，这可使得所公开的疾病或病况的治疗改善并且避免非所需路径调节(其将导致副作用)。选择性调节优先活化星形胶质细胞或其它神经胶质细胞，如微神经胶质细胞和少突细胞。适用于本发明的某些尿苷类似物化合物公开于wo2014/160502中，其以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，化合物是a3r激动剂。在一些实施例中，化合物是p2y1受体激动剂。在一些实施例中，化合物是腺苷受体，如a1、a2a、a2b或a3受体处的偏置激动剂。在一些实施例中，化合物是a3受体处的偏置激动剂、部分激动剂或偏置部分激动剂。在一些实施例中，化合物是p2y1受体处的偏置激动剂、部分激动剂、或偏置部分激动剂。在一些实施例中，化合物选自由以下组成的群组：
或其磷酸化类似物；或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，化合物选自：
(参见beukersmw等人,(2004)“相较于参考激动剂n-乙基甲酰氨基腺苷具有改进的选择性型态的人类腺苷a2b受体的新的、非腺苷、高效能激动剂(new,non-adenosine,high-potencyagonistsforthehumanadenosinea2breceptorwithanimprovedselectivityprofilecomparedtothereferenceagonistn-ethylcarboxamidoadenosine)”,药物化学杂志(j.med.chem.)47(15):3707-3709)；
或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物选自(n)-甲醇碳核苷，如以上所公开的那些；或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，化合物选自或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物选自由以下组成的群组：
其中每种化合物可呈北或南构象，或甲醇碳糖可以被d-核糖置换；或其药学上可接受的盐；或其单、二或三磷酸盐或单、二或三磷酸盐的药学上可接受的盐。在一些实施例中，甲醇碳糖为d-(n)-甲醇碳糖。在一些实施例中，甲醇碳糖为d-(s)-甲醇碳糖。
在一些实施例中，化合物选自或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，化合物选自
在一些实施例中，化合物为或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物为或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物为或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，化合物为或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物为或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物为或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物为或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物为
在一个方面，本发明提供包含所公开的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的赋形剂的医药组合物。在一些实施例中，化合物为或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物为或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物为或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物为
在一些实施例中，化合物选自图9中的那些，或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，化合物选自(mrs1898)或mrs1873(ast-008)；或其药学上可接受的盐。
其药学上可接受的盐或包含其的药学上可接受的组合物。
在一些实施例中，化合物为人类a3腺苷受体(a3r)下的偏置部分激动剂。
在一些实施例中，使a3r以朝向a3r受体的神经保护性功能偏置的方式部分地激动。
在一些实施例中，化合物经口、静脉内或非经肠施用。
在一些实施例中，化合物或其药学上可接受的盐具有至少0.7的未结合的血浆部分或至少0.08的未结合的脑部分或两者都有。
在一些实施例中，通过较少或无细胞内钙移动的优先活化、其它a3r介导的路径的活化，或通过gq11介导的细胞内钙移动的优先活化、camp产生的gi介导的调节、或erk1/2和akt的gi介导的磷酸化，使a3r以朝向a3r受体的神经保护性功能的偏置方式激动。
在一些实施例中，经口施用化合物。
所公开方法中使用的组合物或所公开药物组合物中应存在的所公开化合物(即，活性剂)的量一般将为治疗有效量。“治疗有效量”或剂量(或“有效量”)是指足以产生所需治疗结果的活性剂的量。活性剂的组合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养或实验动物领域中已知的程序、例如通过测定ld50(对于测试组中50％致死的剂量)和ed50(对于测试组中50％治疗有效的剂量)来测定。毒性与治疗作用之间的剂量比是治疗指数并且其可以表示为比率ld50/ed50。展现大的治疗指数的组合物是有利的。从细胞培养分析和动物研究中获得的数据可以用于配制适用于人类的一系列剂量。在一些实施例中，此类化合物的剂量处于包括ed50并且毒性极低或无毒性的循环浓度范围内。剂量可以根据所用剂型和所用施用途径而在此范围内变化。
所公开的治疗方法可涵盖按需要施用所公开的化合物以获得所需治疗效果。可按照维持所需治疗作用(如预防作用，例如预防成瘾或风险行为复发)必需的时长来施用组合物。在一些实施例中，在约一个月至12个月之间施用化合物。在一些实施例中，在一个月至六个月之间施用化合物。在一些实施例中，在一个月至三个月之间施用化合物。
在本发明的一个方面中，以约5毫克/天至10克/天的量施用所公开的化合物。在一些实施例中，化合物的每个剂量是约5毫克/剂量至10克/剂量的量。举例来说，通过以每天一次或以分次剂量2到4次施用的约0.05至10毫克/千克/天、约0.1至7.5毫克/千克/天、约0.1至2毫克/千克/天或0.5毫克/千克/天的剂量经口施用本发明的所公开的化合物而获得令人满意的结果。对于非经肠施用、例如藉由静脉内滴注或输注，可使用约0.01至5毫克/千克/天、约0.05至1.0毫克/千克/天以及约0.1至1.0毫克/千克/天的剂量。对于患者合适的日剂量因此为约2.5至500mg(经口)、约5至250mg(经口)、约5至100mg(经口)或约0.5至250mg(静脉内)、约2.5至125mg(静脉内)以及约2.5至50mg(静脉内)。
4.用途、配制物和施用
药学上可接受的组合物
根据另一实施例，本发明提供包含所公开的化合物和药学上可接受的载剂、佐剂或媒剂的组合物。在某些实施例中，配制本发明组合物用于向需要此类组合物的患者施用。在一些实施例中，本发明组合物被配制成用于向患者经口施用。
如本文所用，术语“患者”意指动物，优选哺乳动物，并且最优选人类。
术语“药学上可接受的载剂、佐剂或媒剂”是指不会破坏一起配制的化合物的药理学活性的无毒载剂、佐剂或媒剂。可以在本发明组合物中使用的药学上可接受的载剂、佐剂或媒剂包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(如人血清白蛋白)、缓冲物质(如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐)、胶态二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
“药学上可接受的衍生物”意指在向接受者施用后能够直接或间接提供本发明的化合物或其抑制活性代谢物或残余物的本发明化合物的任何无毒盐、酯、酯的盐或其它衍生物。
本发明的组合物可以经口、非经肠、通过吸入喷雾、局部、经直肠、经鼻、经颊、经阴道或经由植入式贮存器施用。如本文所用，术语“非经肠”包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。在一些实施例中，经口、腹膜內或静脉内施用组合物。本发明组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。这些悬浮液可以根据所属领域中已知的技术使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒非经肠可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如呈在1,3-丁二醇中的溶液形式。可以采用的可接受的媒剂和溶剂中包括水、林格氏溶液和等张氯化钠溶液。另外，常规地采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。
出于此目的，可以采用任何温和不挥发性油，包括合成单酸甘油酯或二酸甘油酯。例如油酸的脂肪酸和其甘油酯衍生物如天然药学上可接受的油(例如橄榄油或蓖麻油，尤其呈其聚氧乙基化形式)般适用于制备可注射剂。这些油溶液或悬浮液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或常用于配制药学上可接受的剂型(包括乳液及悬浮液)的类似分散剂。出于配制的目的，也可以使用其它常用的表面活性剂(例如吐温(tween)、斯潘(span))和常用于制造药学上可接受的固体、液体或其它剂型中的其它乳化剂或生物可用性增强剂。
本发明的药学上可接受的组合物可以任何经口可接受剂型经口施用，所述剂型包括但不限于胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液。在用于经口使用的片剂的情况下，常用的载剂包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂，例如硬脂酸镁。对于以胶囊形式经口施用，适用的稀释剂包括乳糖和干燥玉米淀粉。当口服使用需要水性悬浮液时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂合并。必要时，也可以添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。
或者，本发明的药学上可接受的组合物可以按用于经直肠施用的栓剂形式施用。这些栓剂可通过将药剂与适合的非刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂在室温下是固体但在直肠温度下是液体并且因此将在直肠中熔融以释放药物。所述物质包括可可脂、蜂蜡以及聚乙二醇。
本发明的药学上可接受的组合物还可以局部施用，尤其当治疗目标包括通过局部施用容易达到的区域或器官(包括眼睛、皮肤或下部肠道的疾病)时。容易制备适用于这些区域或器官中的每一个的局部配制物。
对下部肠道的局部施用可以直肠栓剂配制物(参见上文)或以合适的灌肠剂配制物实现。也可以使用局部经皮贴片。
对于局部施用来说，所提供的药学上可接受的组合物可以含有悬浮或溶解于一或多种载剂中的活性组分的适合软膏形式配制。用于本发明化合物的局部施用的载剂包括但不限于矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。可替代地，所提供的药学上可接受的组合物可以含有悬浮或溶解于一或多种药学上可接受的载剂中的活性组分适合的洗剂或乳膏形式配制。合适的载剂包括但不限于矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
对于眼科使用，所提供的药学上可接受的组合物可以在存在或不存在如苯扎氯铵的防腐剂情况下，配制为于ph经调整的等张无菌生理食盐水中的微粉化悬浮液或配制为于ph值经调整的等张无菌生理食盐水中的溶液。或者对于眼科使用，药学上可接受的组合物可在如矿脂的软膏中配制。
本发明的药学上可接受的组合物还可以通过经鼻雾剂或吸入施用。所述组合物根据药物配制领域中所熟知的技术制备，并且可以采用苯甲醇或其它适合防腐剂、增强生物可用性的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其它常规增溶剂或分散剂，以于生理食盐水中的溶液形式制备。
在一些实施例中，本发明的药学上可接受的组合物经配制用于经口投药。所述配制物可以与或不与食物一起施用。在一些实施例中，本发明的药学上可接受的组合物在不存在进食的情况下施用。在其它实施例中，本发明的药学上可接受的组合物与食品一起施用。
在其它实施例中，本发明的药学上可接受的组合物被配制用于静脉内(iv)施用。
可以与载剂材料组合以产生呈单一剂型的组合物的本发明化合物的量将根据所治疗的宿主、特定施用模式而变化。优选地，应该配制所提供的组合物以使得可以向接受这些组合物的患者施用剂量为0.01-100毫克/千克体重/天的抑制剂。
化合物和药学上可接受的组合物的用途
本文所描述的化合物和组合物通常适用于治疗各种疾病和病况，如脑损伤和神经退化性病况以及本文中所公开的各种方法。
用于本发明的化合物的活性可在体外、体内或在细胞系中分析。体外分析包括调节或结合到蛋白质的分析。分析化合物的详细情况阐述于以下实例中。
如本文所用，术语“治疗(treatment/treat/treating)”是指逆转、减轻如本文所描述的疾病或病症或其一或多种症状，延迟其发作，或抑制其进展。在一些实施例中，治疗可在已出现一或多种症状后施用。在其它实施例中，治疗可以在不存在症状的情况下施用。举例来说，治疗可以在症状发作之前向易感个体(例如，根据症状病史和/或根据遗传学或其它易感性因素)施用。还可以在症状已经消退之后继续进行治疗，例如以预防或延迟其复发。
视所治疗的疾病或病况的严重程度而定，本发明的药学上可接受的组合物可以经口或经鼻喷雾剂经口、舌下、经直肠、非经肠、脑池内、阴道内、腹膜內、局部(如通过粉剂、软膏或滴剂)、眼内(如滴眼剂)、经颊对人类和其它动物施用。在某些实施例中，可以每天、一天一或多次针对受试者体重按约0.01mg/kg至约50mg/kg或约1mg/kg至约25mg/kg的剂量水平，经口或非经肠施用本发明的化合物，以获得所需治疗作用。
用于经口投药的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性化合物外，液体剂型还可以含有所属领域中常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇脂肪酸酯和其混合物。除惰性稀释剂之外，口服组合物还可以包括佐剂，如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。
可根据已知技术使用适合分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液。无菌可注射制剂也可以是在无毒非经肠可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液，例如呈1,3-丁二醇中的溶液形式。可以采用的可接受媒剂和溶剂中包括水、林格氏溶液、u.s.p.和等张氯化钠溶液。另外，常规地采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。出于此目的，可以采用任何温和的不挥发性油，包含合成单甘油酯或二甘油酯。此外，在可注射剂制备中使用脂肪酸，例如油酸。
可注射配制物可以例如通过经由细菌截留过滤器过滤或通过并入灭菌剂来灭菌，呈可以在使用前溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中的无菌固体组合物形式。
为了延长本发明化合物的作用，通常需要皮下或肌肉内注射的化合物缓慢吸收。这可以通过使用具有较差水溶解度的结晶或非晶形材料的液体悬浮液来实现。化合物的吸收速率则取决于其溶解速率，溶解速率又可以取决于晶体大小和结晶形式。或者，通过将化合物溶解或悬浮于油媒剂中来实现非经肠施用的化合物形式的延迟吸收。通过形成化合物在生物可降解聚合物(如聚丙交酯-聚乙交酯)中的微胶囊基质来制备可注射积存形式。取决于化合物与聚合物的比率和所用特定聚合物的性质，可以控制化合物的释放速率。其它可生物降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还通过将化合物截留于与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备积存可注射配制物。
用于经直肠或经阴道施用的组合物优选是可以通过将本发明化合物与适合的无刺激性赋形剂或载剂(如可可脂、聚乙二醇，或在环境温度下是固体但在体温下是液体并且因此在直肠或阴道腔中融化并释放活性化合物的栓剂蜡)混合而制备的栓剂。
用于经口投药的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、散剂和颗粒。在此类固体剂型中，活性化合物与以下各者混合：至少一种惰性的药学上可接受的赋形剂或载剂，如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或a)填充剂或增量剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；b)粘合剂，如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；c)保湿剂，如甘油；d)崩解剂，如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶液迟延剂，如石蜡；f)吸收促进剂，如季铵化合物；g)湿润剂，如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；h)吸收剂，如高岭土和膨润土；和i)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠和其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包含缓冲剂。
还可以使用类似类型的固体组合物作为使用如乳糖及高分子量聚乙二醇等的赋形剂的软和硬填充明胶胶囊中的填充剂。固体剂型片剂、糖衣药丸、胶囊、丸剂及颗粒剂可以用包衣和外壳(例如肠溶包衣和医药配制领域中众所周知的其它包衣)来制备。其可任选地含有乳浊剂，并且还可为其仅在肠道的某一部分中，任选地以延迟方式释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。还可以使用类似类型的固体组合物作为使用如乳糖及高分子量聚乙二醇等的赋形剂的软和硬填充明胶胶囊中的填充剂。
活性化合物还可呈与如上文所提及的一或多种赋形剂的微胶囊化形式。片剂、糖衣药丸、胶囊、丸剂以及颗粒的固体剂型可以用包衣和外壳(如肠溶衣、释放控制包衣以及药物配制技术中众所周知的其他包衣)来制备。在这些固体剂型中，活性化合物可以与至少一种惰性稀释剂(如蔗糖、乳糖或淀粉)混合。按照惯例，这些剂型还可以包含除惰性稀释剂以外的附加物质，例如压片润滑剂和其它压片助剂，如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可包含缓冲剂。其可任选地含有乳浊剂，并且还可为其仅在肠道的某一部分中，任选地以延迟方式释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。
用于局部或经皮施用本发明化合物的剂型包括软膏、糊剂、乳膏、乳剂、凝胶、散剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴剂。在无菌条件下将活性组分与药学上可接受的载剂和任何所需的防腐剂或缓冲剂按要求混合。眼科配制物、滴耳剂和滴眼剂也涵盖在本发明范围内。另外，本发明涵盖了使用经皮贴片，其具有提供化合物向身体的控制传递的额外优点。所述剂型可以通过将化合物溶解或分配于适当介质中制得。还可以使用吸收增强剂来增加化合物穿过皮肤的通量。可以通过提供速率控制膜或将化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制速率。
取决于待治疗的特定病况或疾病，通常施用以治疗所述病况的其它治疗剂也可以存在于本发明组合物中。如本文所用，通常施用以治疗特定疾病或病况的其它治疗剂被称为“适于所治疗的疾病或病况”。
如以下实例中所描绘，在某些示例性实施例中，化合物根据以下一般程序制备和使用。应了解，虽然一般方法描绘了某些本发明化合物的合成，但以下一般方法和本领域普通技术人员已知的其它方法可以适用于如本文中所述的所有化合物和这些化合物中的每一者的子类和种类。
说明书中所引用的每个文件的内容以其全文引用的方式并入本文中。
例证
实例1：ast-004对可卡因自施用小鼠的影响
本研究被认为首先检查能量代谢与药物成瘾之间的关联。
出版的作品表明可卡因自施用小鼠在vta中展现显著较高的谷氨酸水平。这似乎至少部分归因于谷氨酸吸收至星形胶质细胞中的损失。我们的数据聚焦于降低的谷氨酸可用性对星形胶质细胞功能的影响和此功能丧失如何影响神经元活性和觅药行为。
我们的数据展示星形胶质细胞中的线粒体代谢可通过用刺激ip3ca2+信号传导的g蛋白偶联激动剂处理来增加(下文的参考1)。
我们发现ast-004是刺激细胞内ca2+的a3r激动剂(图1)。在整个记录中保持ca2+释放的低水平刺激(图1a、b)。其未被百日咳毒素处理阻断，与gq偶联一致。整合ca2+反应也是剂量依赖性的(图1c)，且存在于从小鼠、大鼠、猪和人脑组织培养的星形胶质细胞。
我们先前报道任何刺激星形胶质细胞中ip3介导的ca2+增加的激动剂会增加星形胶质细胞中的atp产量(1)。为了确认ast-004诱导的ca2+释放也增加代谢，我们培养星形胶质细胞(c8-d1a，购自atcc)且使用标准seahorse室(24孔)测量耗氧率(ocr)。如图2所示，基础呼吸起初在所有三个实验中类似，但当将ast-004添加至浴槽中时增加(15分钟，第一箭头)。在对照注射下观察到极小变化。寡霉素注射展现对于用ast-004(400nm)处理的星形胶质细胞，atp产量显著更大。通过添加fccp(对三氟甲氧基羰基氰化物苯腙)使细胞解偶联展现对于用ast-004处理的星形胶质细胞，最大呼吸也显著更高。添加鱼藤酮和抗霉素揭开耗氧的非线粒体源，其在计算之前从所有测量结果减去。
我们接着使用我们确立已久的光栓塞诱导中风模型来测试ast-004的预测神经保护功效(2,3)。如所预期，我们发现ast-004处理显著减小中风梗塞体积(图3a、b)，其被用a3r拮抗剂mrs1523预处理阻断(图3c)。ast-004在小鼠的创伤性脑损伤(tbi)之后也是神经保护性的(图4)。
体内生物发光成像指示a3r激动剂ast-004增加星形胶质细胞中的atp(图5)。表达星形胶质细胞中的荧光素酶报导基因(gfap启动子，dual-glo小鼠，杰克逊实验室(jacksonlaboratories))的转基因小鼠经受钝tbi(密闭式皮质撞击)。初始创伤之后2至4天，向小鼠腹膜内注射合成d-荧光素类似物(cycluc1)且在ivisspectrumimager上记录生物发光信号(图5a)。相比于注射媒剂的小鼠，注射ast-004的小鼠展现显著更高的光子通量水平，与星形胶质细胞中更高的atp产量一致(图5b)。
p2y1r和a3r激动剂以取决于glud1表达的方式增加星形胶质细胞中的线粒体atp产量。一个可能的假设是谷氨酸分解代解为α-kg是由glud1介导，其通过tca循环中icdh和α-kgdh的ca2+依赖性刺激增强。为了测试此假设，通过用特定shrna培育细胞降低了星形胶质细胞培养物中的glud1表达水平。蛋白质印迹分析展示glud1水平降低80％(图6a、b)。当这些细胞用mrs2365(p2y1r激动剂)处理20分钟时，atp水平显著增加，但仅在对照细胞(加扰shrna)中。glud1水平降低的星形胶质细胞不是反应性的(图7a)。这些数据与我们实验室使用不同p2y1r激动剂，2-mesadp的更早操作一致。我们在半乳糖(迫使细胞通过氧化磷酸化产生atp的碳源)存在下重复这些实验，因为半乳糖的糖酵解是atp中性的。我们发现glud1水平降低的星形胶质细胞类似地对p2y1r刺激无反应(图7b)。ast-004也以glud1依赖性方式提高atp水平(图7c)。
方案和方法：
原代细胞培养物
方案从麦卡锡等人,1980修改(4)。简单来说，小鼠用异氟醚麻醉，接着进行颈脱位。将脑快速去除且在胰蛋白酶中切碎，且使其在37℃下培育30分钟。添加具有10％fcs和primocin的dmem/f-12培养基且将脑湿磨至均化且通过100μm筛过滤，且接种至培养瓶中。次日，将匀浆转移至新的瓶，且向前一个瓶添加新培养基。细胞生长3-4周，每3-4天更换dmem/f-12培养基直至细胞为70％汇合。
对于腹侧被盖区(vta)星形胶质细胞，将vta脑区提取、汇集且将星形胶质细胞在进行实验之前培养至少2周。
shrna敲落
细胞用获自圣克鲁兹(santacruz)的shrna慢病毒构筑体(glud1#145446-v，用于scrambled#108080)转导。细胞接着以单细胞/孔密度在96孔培养皿中接种且被选择用于与嘌呤霉素一起。克隆经生长且通过蛋白质印迹来测试敲落。
对经培养细胞的蛋白质印迹
经培养细胞用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤两次，且添加具有pi的ripa缓冲液(罗氏(roche))。细胞使用细胞铲(celllifter)刮擦且置于1.7ml微量离心管(eppendorftube)中。对细胞进行短暂声处理且在预冷的台式离心机上以最大速度离心20分钟(min)。为了测定蛋白质浓度，使用bca分析(赛默飞世尔(thermofisher))。将蛋白质负载于10％sds-聚丙烯酰胺凝胶上且转移至硝化纤维素。在5％牛奶/tbst或3％bsa/tbst中阻断印迹。针对gdh(蛋白技术(proteintech)，1:1000)、gfap(阿布凯姆(abcam)，1:500)、glast(1:500)、肌动蛋白(西格玛(sigma)，1:1000)和谷氨酰胺合成酶(1:250)探测印迹。使用imagej软件来测定光密度测定法，且使用graphpadprism软件分析统计结果。
测定atp水平
ca2+测量
如先前所述地对ca2+活性成像(5)。简单来说，将星形胶质细胞在各实验之前接种于盖玻片上3和4夜。在实验之前将培养皿与荧光ca2+敏感性染料(10μm，cal520，细胞渗透，阿布凯姆)一起培育30分钟。用共聚焦激光扫描显微镜以每秒1.5个图像的速率获取图像。在室温下在记录缓冲液(120mmnacl，4.5mmkcl，1mmcacl2，2mmmgcl2，10mmhepes，ph7.4)中获得数据。用imagej和niselements分析图像。
耗氧率(ocr)
测量ocr以计算线粒体呼吸且用seahorsexf96细胞外通量分析仪进行。96孔系统以约5分钟的间隔从培养的完整细胞的单层测量ocr。在ocr测量之前至少2天将星形胶质细胞接种于seahorse微量培养板上。通过依序添加atp合成酶抑制剂寡霉素(其对应于归于atp合成酶的ocr(其余的ocr为质子泄漏))，接着添加fccp(其为使线粒体解偶联且展现最大呼吸的质子离子载体)用此仪器测量线粒体呼吸控制的所有主要方面。注射鱼藤酮和抗霉素(分别为复合物i和iii的抑制剂)揭开非线粒体耗氧量。
光栓塞诱导中风和测定病变体积
如先前(2,3)所描述地进行中风，不同之处在于高速电钻(精细科学工具(finesciencetools))用于进行颅骨切开术且nikoneclipsete200用于以561nm激光照亮容器直至显现血块。接着在中风形成后的30分钟内向动物腹膜内注射陈述浓度的100μl药物或注射媒剂。
为了定量病变体积，小鼠用异氟醚麻醉，且经由颈脱位接着断头来处死。快速去除脑且短暂置于冰冷的pbs中，接着使用脑模具(脑树科学(braintreescientific))切成1mm切片。将切片置于0.5％2,3,5氯化三苯基四氮唑(ttc，西格玛阿尔德里奇(sigmaaldrich))中且在37℃下培育8分钟，翻转且再培育8分钟。去除ttc，且将脑在8％多聚甲醛(pfa)中培育过夜，随后使用平面扫描器扫描且使用imagej计算病变面积(如由白色、未染色组织指示)。对于一些脑，取用同侧半球进行ttc染色，且将对侧组织在液氮中速冻且储存于-80℃下直至用于蛋白质印迹分析。使用graphpadprism软件分析统计结果。
可卡因自施用
参考文献
1吴(wu),j.等人嘌呤能受体刺激的ip3介导的ca2+释放通过增加老化期间的星形胶质细胞线粒体代谢而增强神经保护(purinergicreceptor-stimulatedip3-mediatedca2+releaseenhancesneuroprotectionbyincreasingastrocytemitochondrialmetabolismduringaging).神经科学杂志(jneurosci)27,6510-6520,doi:10.1523/jneurosci.1256-07.2007(2007)。
2郑(zheng)w.,塔利瓦特(talleywatts),l.,荷尔斯泰因(holstein),d.m.,韦威尔(wewer),j.和勒什莱泰(lechleiter),j.d.星形胶质细胞粒线体代谢的p2y1r引发的ip3r依赖性刺激减轻和部分逆转小鼠的缺血性神经元损伤(p2y1r-initiated,ip3r-dependentstimulationofastrocytemitochondrialmetabolismreducesandpartiallyreversesischemicneuronaldamageinmouse.)脑血流与代谢杂志(jcerebbloodflowmetab)33,600-611,doi:10.1038/jcbfm.2012.214(2013)。
3郑,w.等人嘌呤能受体刺激减少通过向神经胶质线粒体供能进行光栓疗法诱导的小鼠细胞毒性水肿和大脑梗死(purinergicreceptorstimulationreducescytotoxicedemaandbraininfarctsinmouseinducedbyphotothrombosisbyenergizingglialmitochondria).公共科学图书馆·综合(plosone)5,e14401,doi:10.1371/journal.pone.0014401(2010)。
4麦卡锡(mccarthy),k.d.和德威利斯(devellis),j.从大鼠脑组织制备分离的星形胶质细胞和寡树突神经胶质细胞细胞培养物(preparationofseparateastroglialandoligodendroglialcellculturesfromratcerebraltissue).细胞生物学杂志(jcellbiol)85,890-902(1980)。
5林(lin),d.t.等人老化星形胶质细胞中的ca2+信号传导、线粒体和对氧化应激的敏感性(ca2+signaling,mitochondriaandsensitivitytooxidativestressinagingastrocytes).老化神经生物学(neurobiolaging)28,99-111,doi:10.1016/j.neurobiolaging.2005.11.004(2007)。
6麦考尔(mccall),n.m.等人选择性消融多巴胺神经元中的girk通道改变可卡因于小鼠中的行为效应(selectiveablationofgirkchannelsindopamineneuronsaltersbehavioraleffectsofcocaineinmice).神经精神药理学:美国神经精神药理学学院的官方出版物(neuropsychopharmacology:officialpublicationoftheamericancollegeofneuropsychopharmacology)42,707-715,doi:10.1038/npp.2016.138(2017)。
7夏普(sharpe),a.l.,瓦雷拉(varela),e.,贝廷格(bettinger),l.和贝科斯泰德(beckstead),m.j.小鼠自我用甲基安非他明减少中脑多巴胺神经元中girk通道介导的电流(methamphetamineself-administrationinmicedecreasesgirkchannel-mediatedcurrentsinmidbraindopamineneurons).国际神经精神药理学杂志(intjneuropsychopharmacol)18,doi:10.1093/ijnp/pyu073(2014)。
实例2：用于确定化合物于a3腺苷受体(a3r)下的偏置激动作用的实验方案
以下分析可用于确定所公开的化合物，如ast-004或mrs1873(ast-008)，是否展现a3受体下的偏置激动作用(也称为功能选择性或激动剂运输)。
材料。fluo-4、杜氏改良伊格尔培养基(dulbecco'smodifiedeagle'smedium，dmem)和青霉素-链霉素可购自英杰公司(invitrogen)(加利福尼亚州卡尔斯巴德(carlsbad,ca))。腺苷脱氨酶(adenosinedeaminase，ada)和湿霉素-b可购自罗氏(瑞士巴塞尔(basel,switzerland))。胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)可购自赛墨特拉斯(thermotrace)(澳大利亚墨尔本(melbourne,australia))。alphascreensurefire细胞外信号调控的激酶1和2(erk1/2)、akt1/2/3和camp试剂盒可从珀金埃尔默(perkinelmer)(马萨诸塞州波士顿(boston,ma))获得。前缀是mrs的所有化合物可如先前所描述进行合成(托什(tosh)等人,2012a,b)。所有其它试剂均购自西格玛-阿尔德里奇(密苏里州圣路易斯)。
细胞培养。使用事先描述的方法，人类a3r的序列可克隆到gateway进入载体pdonr201中，并且接着在gateway目的载体pef5/frt/v5-dest中转移(斯图尔特(stewart)等人,2009)。a3-flpin-cho细胞可使用先前描述的方法产生(梅(may)等人,2007)并且在含有补充有10％fbs和选择抗生素湿霉素-b(500μg/ml)的dmem中的5％co2的含湿气培育箱中维持在37℃下。为了细胞存活、erk1/2磷酸化、akt1/2/3磷酸化和钙移动分析，细胞可以4×104个细胞/孔的密度接种到96孔培养板中。6小时后，细胞用无血清dmem洗涤并且在分析之前在37℃下在5％co2中维持于无血清dmem中12-18小时。为了camp分析，细胞可以2×104个细胞/孔的密度接种到96孔培养板中并且在分析之前在37℃下在5％co2中培育过夜。
细胞存活分析。在不存在和存在a3r配体的情况下，培养基被去除并且用含有ada(1u/ml)和青霉素-链霉素(0.05u/ml)的hepes-缓冲盐水溶液(10mm4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)、146mmnacl、10mmd-葡萄糖、5mmkcl、1mmmgso4、1.3mmcacl2和1.5mmnahco3，ph7.45)替换。板接着在含湿气培育箱中维持于37℃下24小时，之后将5mg/ml碘化丙锭加入细胞。板可接着在envision读板器(珀金埃尔默)上读取，其中激发和发射分别设定为320nm和615nm。数据将被归一化为100％细胞存活和0％细胞存活，分别在t＝0小时于hepes缓冲液中并且在t＝24小时于milli-q水中测定。
erk1/2和akt1/2/3磷酸化分析。每个配体的erk1/2和akt1/2/3磷酸化的浓度反应曲线可以在含有1u/mlada的无血清dmem中进行(在37℃下暴露5分钟)。激动剂刺激可通过去除培养基并且将100mlsurefire溶解缓冲液加入每个孔中来终止。接着搅动板5分钟。perk1/2的检测可涉及384孔proxiplate中的11ml总体积的溶胞物:活化缓冲液:反应缓冲液:alphascreen受体珠粒:alphascreen供体珠粒的80:20:120:1:1v/v/v/v/v稀释液。板可在37℃下于暗处培育1小时，之后通过envision读板器(珀金埃尔默)来测量荧光，其中激发和发射分别设定为630nm和520-620nm。akt1/2/3磷酸化的检测可采用384孔proxiplate中的9l总体积的溶胞物:活化缓冲液:反应缓冲液:alphascreen受体珠粒的40:9.8:39.2:1v/v/v/v稀释液。板可在室温下于暗处培育2小时，之后可添加11μl总体积的稀释缓冲液:alphascreen供体珠粒的19:1v/v稀释液。板可再在室温下于暗处培育2小时，之后通过envision读板器(珀金埃尔默)来测量荧光，其中激发和发射分别设定为630nm和520-620nm。将激动剂浓度-反应曲线归一化为由10％fbs介导的磷酸化(5分钟刺激)。
钙移动分析。培养基可从96孔板去除并且用含有1u/mlada、2.5mm丙磺舒、0.5％牛血清白蛋白(bsa)和1mfluo4的hepes缓冲盐水溶液替换。可在37℃下在含湿气培育箱中将板于暗处培育1小时。flexstation读板器(加利福尼亚州森尼韦尔分子仪器公司(moleculardevices,sunnyvale,ca))可在不存在和存在激动剂的情况下进行添加hepes缓冲盐水溶液并且每1.52秒测量荧光(激发，485nm；发射，520nm)，持续75秒。峰值与基线荧光之间的差异可测量为细胞内ca2+移动的标记。a3r激动剂浓度反应曲线可归一化为由100μmatp介导的反应以解释细胞数量和负载效率的差异。
camp积累分析的抑制。培养基可以用刺激缓冲液(140mmnacl，5mmkcl，0.8mmgso4，0.2mmna2hpo4，0.44mmkh2po4，1.3mmcacl2，5.6mmd-葡萄糖，5mmhepes，0.1％bsa，1u/mlada和10μm咯利普兰，ph7.45)替换并且在37℃下培育1小时。camp积累的抑制可通过与a3r激动剂一起预培育a3-flpin-cho细胞10分钟来评估，此后再添加3μm弗斯可林(forskolin)后维持30分钟。反应可通过快速去除缓冲液和添加50μl冰冷的100％乙醇来终止。在添加50μl检测缓冲液(0.1％bsa，0.3％吐温-20，5mmhepes，ph7.45)之前使乙醇蒸发。搅动板10分钟，之后将10μl溶胞物转移至384孔optiplate中。检测可采用添加alphascreen受体珠粒:刺激缓冲液的5μl1:49v/v稀释液。然后，15μl的alphascreen供体珠粒:检测缓冲液:3.3u/μl生物素标记的camp的1:146:3v/v/v稀释液形成30μl的总体积。供体珠粒/生物素标记的camp混合物可在添加之前平衡30分钟。可将板在室温下于暗处培育过夜，之后通过envision读板器(珀金埃尔默)来测量荧光，其中激发和发射分别设定为630nm和520-620nm。激动剂浓度反应曲线可归一化为仅由3μm弗斯可林(0％)或缓冲液(100％)介导的反应。
分子建模。对接模拟可使用人类a3r的同源模型针对在本研究中研究的所有化合物进行。具体地说，可使用三个先前报告的模型：完全基于激动剂结合的ha2aar晶体结构的模型(pdbid:3qak)、基于混合a2aar-β2肾上腺素受体模板的模型和基于混合a2aar-视蛋白模板的模型(β2肾上腺素受体x射线结构pdbid:3sn6；视蛋白晶体x射线晶体结构pdbid:3dqb)(托什等人,2012a)。相比于基于a2aar的模型，基于杂交模板的模型将展示tm2向外移动。使用实施于套件中的builder和ligprep工具，可针对对接建构和制备a3r配体的结构(release2013-3,llc,newyork,ny,2013)。a3r模型处配体的分子对接可借助于套件的glide零件包执行。具体地说，glidegrid可在腺苷受体，即phe(el2)、asn(6.55)、trp(6.48)和his(7.43)的结合袋的一些关键残基的质心上居中。glidegrid可使用的内盒(配体直径中点盒)和在每一方向上从内盒延伸的外盒(其中必须含有所有配体的盒)建构。配体的对接可以使用xp(超精确度)程序在刚性结合部位中进行。每种配体的顶部评分对接构象可经历蛋白质-配体相互作用的目测和分析以选择与实验数据一致的所提出的结合构象。
数据分析。统计分析和曲线拟合可以使用prism6(加利福尼亚州圣地亚哥graphpad软件(graphpadsoftware,sandiego,ca))进行。为定量信号传导偏置，激动剂浓度-反应曲线可使用如先前所描述的激动作用的black-leff操作模型的求导通过非线性回归来分析(肯纳金(kenakin)等人,2012；武腾(wootten)等人,2013；凡德韦斯特赫伊曾(vanderwesthuizen)等人,2014)。转导系数τ/ka[表述为对数，log(τ/ka)]可用于定量偏置激动作用。为解释对激动剂反应的细胞依赖性作用，转导比率可归一化为针对参考激动剂ib-meca获得的值以产生alog(τ/ka)。为测定每种激动剂在不同信号传递路径下的偏置，alog(τ/ka)将归一化到参考路径perk1/2以产生aalog(τ/ka)。偏置可定义为10aalog(τ/ka)，其中偏置的缺乏将产生不在统计上不同于1或0(表示为对数时)的值。所有结果可表示为平均6s.e.m。统计分析将涉及f测试或图克(tukey)或邓尼特(dunnett)事后测试的单因素方差分析，其中统计显著性测定为p，0.05。
实例3.ast-004的合成途径
ast-004和类似化合物，如mrs1873(ast-008)可根据所属领域中已知的方法制备。举例来说，ast-004可通过蔡(choi),w.j.等人.有机化学杂志(j.org.chem.)2004,69,2634-2636,托什,d.k.等人嘌呤能信号传导(purinergicsignalling)2015,11,371-387；和欧洲化学杂志(chem.eur.j.),2009,15,6244-6257中描述的以下途径由d-核糖制备。以下流程1和2展示合成途径。
流程1：ast-004的合成
zhancat-1b具有以下结构：
流程2展示合成的剩余部分。
流程2：ast-004的合成(接上)
当描述多个本发明的实施例时，应理解，上文所描述的特定实例可使用常规实验更改以提供利用本发明的化合物和方法的其它实施例。因此，应了解，本发明的范围仅由所附权利要求书而不由已提供的具体实施例定义。