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丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)的分子病毒学—一个基因组，两个非翻译区和十个蛋白质（上）
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朱立新
摘要：世界范围的高感染率,治疗手段和疫苗的缺乏使HCV成为研究的热点。高效体外复制系统的缺乏，高突变率带来的株系间的不一致，为HCV的研究带来了困难。这个病毒的分离鉴定直接依赖于分子生物学手段。同样是使用分子生物学的手段，研究者对这个病毒的结构和各组分的功能进行了研究。本文从分子角度对这个病毒各组分的结构、功能和相互关系进行了综述，并讨论了HCV诱导疾病、免疫逃避的分子机理。
导言
同样由于没有有效的HCV繁殖系统，从分子水平研究HCV很不容易。目前我们对HCV的认识绝大部分建立在重组技术的基础之上。
基因组：一个ORF和两个UTR
组织培养，显微镜观察和繁复的血清学分析都没有能发现HCV。这个机警的病毒是被分子生物学手段所发现的(Choo,etal.,1989)。研究者从大体积的高HCV滴度的猩猩血浆中抽提出核酸，制备cDNA并插入噬菌体基因组中。利用HCV病人血清对几百万个噬菌体克隆进行了筛选，只有一个阳性克隆被检测到。一年之后，这个非甲非乙肝炎病毒基因组的顺序被测定。此病毒则被命名为丙型肝炎病毒。由于相类似的基因组组织形式，HCV和黄病毒以及瘟病毒被归类至同一个病毒科－黄病毒科。正链单链的HCVRNA基因组长约9500nt。其5‘和3‘端都含有非翻译区（UTR），UTR之间是一个大的多蛋白开放阅读框架（ORF）。该ORF编码了一个长约3000氨基酸的多蛋白。研究表明这个多蛋白的切割加工由宿主编码的信号肽酶（结构蛋白）以及HCV编码的蛋白酶（非结构蛋白）共同完成。图1为HCV基因组结构示意图，宿主信号肽酶和病毒蛋白酶的对多蛋白的切割位点标注在示意图上。
5’UTR：内部核糖体进入位点(IRES)
5’UTR包含HCV基因组5’端的341个核苷酸。它是HCV基因组中最保守的部分。以单链和双链RNA特异的RNA酶做的酶学分析和计算机比较分析表明5’UTR含有典型的IRES二级结构(Brown,etal.,1992)。研究者因此推测HCV多蛋白的翻译是不依赖于5’帽子结构的，且不从第一个AUG起始，而是从内部的AUG起始。5’UTR的IRES功能为后来很多工作所证实（Tsukiyama-Kohara，etal.,1992;Wang,etal.,1993;Fukushi,etal.,1994;Rijnbrand,etal.,1995）。比如，Tsukiyama-Kohara，etal.（1992）在体外翻译系统中发现，含大部分5'UTR的mRNA从第四个AUG开始翻译，且5'帽子结构不影响其翻译效率；而当大部分5'UTR序列被缺失以后，5'帽子能大大提高HCVmRNA的翻译效率。几乎全长的5’UTR为核糖体内部起始所必需（Fukushi,etal.,1994;Rijnbrand,etal.,1995）。不改变读码框的插入、缺失和无义突变等实验表明，编码HCV核心蛋白N末端的序列也是IRES的组成部分（Honda,etal.,1996;Reynolds,etal.,1995,Zhao,etal.,1999），然而有人发现纯化的核糖体40S亚基能特异结合不含有HCV核心蛋白编码序列的HCVIRES（Pestova,etal.,1998），这样编码核心蛋白的序列可能只是有利于IRES二级结构的形成。
核心蛋白：重要的结构蛋白，且具有很多重要的非结构功能
将HCV多蛋白的疏水性轮廓和黄病毒及瘟病毒进行比较，结合体外表达研究，人们将多蛋白N末端191个氨基酸定名为核心蛋白（Hijikata,etal.,1991a;Grakoui,etal.,1993a）。一般认为宿主信号肽酶将其从多蛋白上切割下来。核心蛋白的N末端富含碱性氨基酸且高度保守，这和它的重要功能是相一致的。核心蛋白的这一部分负责结合RNA，此功能被定位于氨基酸1-75（Santolini,etal.,1994）。和核心蛋白的功能相符合，HCV核心蛋白能够形成自聚体，使用类似的方法对该功能的定位得出不同的结果：酵母双杂交系统和缺失分析将此功能定位于aa36-91（Matsumoto,etal.,1996）；电泳、酵母双杂交系统、质谱和凝胶过滤色谱分析表明负责核心蛋白自结合的结构域位于蛋白羧端（Yanetal.,1998）。
多年来的研究发现，HCV核心蛋白的成熟形式并非终止在以前认定的aa191。在两种体外哺乳动物表达系统，即痘苗病毒系统和CHO稳定表达株表达系统中均发现HCV核心蛋白的两种形式：一种终止在aa191(p23,23kD)，另一种终止在aa174和aa191之间(p21,21kD)。分析从HCV病人血清中分离得到的HCV核心蛋白，表明p21是天然病毒颗粒的组成部分（Yasui,etal.,1998）。
核心蛋白对转录的调控可能与HCV致病机理有关（如肝癌）。通过对一些重要基因进行转录调控，HCV核心蛋白能抑制fas-和TNF-α介导的细胞凋亡（Ray,etal.,1998b;Marusawa,etal.,1999）。细胞凋亡是机体抗病毒感染的重要手段（Thompson,1995;Nagava,1997），阻断细胞凋亡可能有利于病毒在细胞中建立持久感染，因而可能是丙型肝炎慢性化的机制之一。已发现很多病毒蛋白能抑制细胞凋亡（Wang,etal.,1995;O’Brien,1998;ShislerandGooding,1998）。有研究表明HCV核心蛋白能转化原代大鼠胚胎成纤维母细胞（Rayetal.,1996），表达HCV核心蛋白的小鼠细胞株BALB/3T3A31-I-1的生长失去接触抑制（Tsuchihara,etal.,1999）。更在HCV核心蛋白基因转基因鼠中观察到肝癌的发生（Moriya,etal.,1998）。核心蛋白的致癌能力使人们对它用于疫苗的研究产生怀疑，尽管核心蛋白含有很多体液免疫表位和CTL表位。有关核心蛋白的另一发现加强了这一怀疑：用多种结构的重组HCV-痘苗病毒感染小鼠发现，HCV核心蛋白具有免疫抑制作用（Large,etal.,1999）。
此外，这个多功能的蛋白还被发现参与抑制宿主细胞中mRNA的翻译（Mamiya,etal.,1999）。
E1
HCV多蛋白上氨基酸192到383编码HCV第一个包膜蛋白E1。信号序列aa174到191引导E1共翻译地转膜至内质网中（Hijikata,etal,1991a）。基因工程表达的E1都定位于内质网膜上。和大部分定位于内质网膜的蛋白不同，此蛋白不含有KDEL或KKXX定位信号，其糖链也未经高尔基酶修饰，因而其滞留于内质网膜的机理与众不同，不是使用从顺式高尔基体拯救的机制，而是静态滞留于内质网。静态滞留信号位于E1的穿膜结构域aa311到383（Cocquerel,etal.,1999;Flint,etal.,1999）。E1是一个高度N-糖基化的蛋白，预测的N-糖基化图式位于aa196,209,234,305和325，但突变分析表明第五个糖基化位点并不发生糖基化（Meunier,etal.,1999）。E1的穿膜结构域（TMD）具膜活化的特性，能改变E.coli的细胞膜透性，引起细胞的快速裂解（Ciccaglione,etal.,1998）。这可能是用E.coli表达E1的困难所在，缺失TMD后表达E1获得了成功（Yan,etal.,1994）。
普遍认为在天然状态下E1和包膜蛋白2（E2）形成非共价的聚合物。E1的N末端负责和E2的N末端结合（Yi,etal.,1997）。又发现抗核心蛋白的抗体能将E1和核心蛋白共沉淀，利用缺失作图的方法发现它们相互作用的位置均在蛋白的C末端（Lo,etal.,1996），作者同时发现E2不能和核心蛋白共沉淀，可能核心蛋白和E2之间不存在直接的相互作用。
E1的C末端同时还是包膜蛋白2（E2）的信号序列，引导E2转膜至内质网。
E2和p7
E2有两种形式，两者起始于aa384，终止于aa746或aa809，后者被认为是在aa746/aa747位点加工不完全的产物（Lin,etal.,1994a;Mizushima,etal.,1994b）。p7就是aa747-aa809，目前还没有发现其有何功能。两种形式的E2都是高度糖化的蛋白，糖链约占E2分子量的一半。HCV膜蛋白在真核表达系统中的高效表达加工需要共表达上游的核心蛋白和下游的非结构蛋白NS2（Matsuura,etal.,1994）。在Sf9昆虫细胞中表达E2羧末端缺失的结构C-E1-E2p(1-660)，结果得到很多分子量各异的，加工不完全的膜蛋白产物，它们反应了E1/E2和C/E1位点低效率的切割（Wang,etal.,1997）。人们观测到的基因工程表达的E2分子量相差很大，从58kD到75kD，原因包括：不同的表达系统翻译后加工不同，如酵母和哺乳动物的糖基化的差异；人们使用的不同的HCV基因型可能产生的影响；人们用于检测表达的抗体所识别的表位不同，与不同的膜蛋白形式的反应性不同。
在所有HCV蛋白中，E2的保守性最弱。在E2的N末端有两个高变区（HVR），分别是HVR1（aa390-410）和HVR2（aa474-480）（Hijikata,etal.,1991b;Weiner,etal.,1991）。有证据表明E2蛋白是免疫反应的主要目标。当HCV病人接受干扰素治疗时，E2的突变增加，对于E1没有此现象发生(Zonaro,eral,1994)；在慢性感染过程中，观察到HVR1序列在不断改变，针对HVR1序列的特异抗体也相应地不断改变（Shimuzu,etal.,1994）；E2含有两个以上中和抗体表位（Lechner,etal.,1998），其中一个位于HVR1（Zibert,etal.,1995）。哺乳动物系统表达的E2还被观察到和人细胞有特异的结合（Rosa,etal.,1996）。因此E2成了HCV疫苗开发的主要目标。
和E1类似，位于E2羧端的TMD负责E2在内质网的静态滞留（Duvet,etal.,1998;Cocquerel,etal.,1998）。共表达的E1和E2形成非共价的异二聚体，在结合E1时起主要作用的序列位于aa415-500，两个HVR对于结合E1没有贡献（Yi,etal.,1997）。
有了这些背景，当人们发现E2和细胞表面分子CD81之间的强烈的相互作用，并且，含保护性抗体的血清能阻断E2和CD81的相互作用时（Pilerietal.,1998），很多人便相信CD81是HCV受体分子，尽管没有证据表明HCV和CD81的结合导致病毒进入细胞。反而是有证据表明，HCV和其他黄病毒家族成员结合并通过低密度脂蛋白（LDL）受体进入细胞（Agnello,etal.,1999;Monazahianetal.,1999）：自由LDL能竞争性地阻断HCV和细胞的结合；原来不结合HCV的细胞在表达LDL受体后能结合HCV；提高LDL受体活性后观察到HCV等病毒的内吞也相应提高；并在体外实验中对多种细胞使用抗LDL受体抗体完全阻断了HCV的内吞。但是，用抗LDL受体抗体处理LDL受体缺陷的成纤维母细胞后，仍有少量HCV能进入细胞。看来抗LDL受体是介导HCV入胞的主要受体，但不是唯一受体。
利用多种凝集素亲和柱对从病人血清中分离到的不同基因型的天然病毒粒子进行分析，发现所有基因型的病毒粒子表面的糖基都是N-连接的复杂糖型的糖链，这是在高尔基体被修饰的结果（Sato,etal.,1993）。这似乎和E2静态滞留于内质网膜有矛盾。Bartenschlager等提出的HCV复制模型（图2）将静态滞留于内质网膜的E2和病毒颗粒上经高尔基体修饰的E2联系了起来（Bartenschlager,etal.,2000）。我们的实验结果支持该模型提出的HCV向内质网出芽而非向细胞膜出芽。在痘苗病毒表达系统中单独表达包膜蛋白只能得到糖化较少的E2蛋白，共表达核心蛋白则能得到75kD的高度糖化的蛋白。构建了多个缺失突变克隆，发现高度糖化E2的表达依赖于全长的核心蛋白序列，而E1的共表达则不是必需的（Zhu,etal.,2000）。其原因可能是共表达的核心蛋白能和内质网膜上的E2蛋白结合，形成假病毒颗粒，从而才能脱离静态滞留内质网膜信号的束缚，进入高尔基体得到进一步的糖化。
图2：HCV复制周期的假说模型。
感染宿主细胞（大方框）后，正链RNA基因组被释放至细胞质，以之为模板进行翻译。继而所得的多蛋白被加工，病毒蛋白与内质网膜紧密联系。表达产物中的复制酶NS3-5合成负链RNA并以之为模板合成大量的正链RNA。正链RNA然后和核心蛋白相接触并被包裹为核心颗粒。此颗粒向内质网出芽形成病毒颗粒。病毒颗粒经高尔基体由分泌途径出胞。
看来E2蛋白也不仅仅是一个结构蛋白，它可能是HCV对干扰素的抗性的原因之一(图3)：E2被发现与INF诱导的蛋白激酶PKR（double-RNAactivatedproteinkinase）有结合。后者催化转录起始因子eIF2-alpha的磷酸化，从而下降调节蛋白合成。在表达E2蛋白的细胞中，PKR被抑制，使得在INF存在时翻译照常进行（Tayloretal.,1999）。
图3，HCV蛋白对干扰素治疗的拮抗作用
非结构蛋白2（NS2）
NS2是一个23kD的疏水膜蛋白（Santolini,etal.,1995），包含了多蛋白上的氨基酸序列aa810-1026，是蛋白酶NS2-3的组成部分。宿主信号肽酶催化p7/NS2之间的切割（Mizushima,etal.,1994a），而NS2羧端的切割由NS2自身和非结构蛋白3（NS3）丝氨酸蛋白酶结构域的一部分共同催化，缺失作图将此催化活性定位于氨基酸827和1207之间（Grakoui,etal.,1993b）。NS2-3的这个自催化活性是依赖于锌元素的（Hijikata,etal.,1993）。NS2-3蛋白酶和NS3丝氨酸蛋白酶之间的活性是相互独立的，因为NS2上单个氨基酸突变可以使NS2-3蛋白酶失活，却不影响NS3丝氨酸蛋白酶的活性；另一方面，NS3丝氨酸蛋白酶的突变也不影响NS2/3之间的切割加工（Grakoui,etal.,1993b;Hijikata,etal.,1993）。
NS3和非结构蛋白4A（NS4A）
NS3对应HCV多蛋白aa1027到1657。根据NS3的保守序列花式，它应含有NS2-3蛋白酶活性，丝氨酸蛋白酶活性，解旋酶活性和NTPase活性。
作图分析结果表明，丝氨酸蛋白酶活性位于NS3的N末端1/3处，相应于HCV多蛋白aa1027至1207，突变研究表明它催化了NS3/4A，4A/4B，4B/5A和5A/5B的切割（Bartenschlager,etal.,1993;Bartenschlager,etal.,1994;Linetal.,1994b）。用两种重组痘苗病毒感染细胞，其中一病毒编码NS3蛋白酶失活的NS3-5，另一病毒编码活性的NS3蛋白，发现NS4A/4B，NS4B/NS5A和NS5A/5B能被反式切割，而NS3/4A则不能。稀释不影响NS3/4A的加工证实了NS3/4A的切割是一个分子内的反应。在非结构蛋白的加工动力学研究中没有观察到含NS3的前体，提示在NS2/3和NS3/4A处的加工很迅速，而很多NS4A-NS5B的加工中间物显示其切割加工效率很低。三个高度保守的氨基酸His1083,Asp1107和Ser1165被认为组成了丝氨酸蛋白酶家族典型的催化三联体（Miller,etal.,1990;Bazan,etal.,1988）。
NS4A对应于HCV多蛋白的aa1658至aa1711，由一个非常疏水的N末端和亲水的C末端组成。它是NS3丝氨酸蛋白酶的辅助因子，和NS3一起催化HCV非结构蛋白的酶解加工。NS4A的疏水特性对NS3/NS4A蛋白酶在膜上的定位及其稳定性可能有贡献。NS4A对于NS3/4A和4B/5A之间的切割是必需的，它对于NS4A/4B和5A/5B位点的切割则有促进作用（Failla,etal.,1994）。X-光结晶图像分析显示，结合NS4A显著改变了NS3的构象（Kim,etal.,1996）。作图分析表明NS3的N末端22个氨基酸对于NS3-NS4A的结合很重要（Satoh,etal.,1995），相应地NS4A上负责它们结合的区域位于第21至34位氨基酸（Shimizu,etal.,1996）。由于它们在HCV多蛋白加工中的重要功能，这两个蛋白成了发展抗病毒药物的目标。
NS3的羧端带有RNA解旋酶活性以及NTPase活性（Kim,etal.,1995）。病毒需要解旋酶的原因可能包括：1，在病毒复制及转录时解开双链RNA；2，在病毒蛋白的翻译过程中梳理核糖体前的二级结构。和其他解旋酶一样，NS3解旋酶具有内在的NTPase活性，通过水解NTP为解旋酶提供能量。有证据显示，NS3和NS4A都能分别和NS5B形成复合物，支持它们都是HCV复制复合物的组成部分（Ishido,etal.,1998）。
研究发现这个HCV解旋酶还具有DNA解旋酶活性（Tai,etal.,1996），此活性可能影响宿主细胞活性并在丙型肝炎病理上起作用。在NIH3T3细胞表达NS3时观察到细胞被转化，并在裸鼠里长出了肿瘤。作图分析将此转化活性定位于NS3的N末端，包括丝氨酸蛋白酶结构域和部分的解旋酶/NTPase结构域（Sakamuro,etal.,1995）。