土壤样品于2017年4月采自浙江省建德市人工马尾松林（119°28′E，29°48′N），该地区属亚热带海洋型季风气候，海拔约200m，年均气温17.4℃，年均降水1600mm。土壤类型为凝灰岩发挥的红壤，选择3个林龄均为55年的马尾松林（间隔约2000m），分别标记为M1、M2和M3。五点法采集0~20cm土壤，每个马尾松林采集3个样品，样品分成两份，一份保存于–20℃用于提取土壤总DNA，另一份4℃保存用于土壤理化性质测定。
土壤含水量采用烘干法。pH采用电位法测量，水土比为5:1。有机碳含量通过浓硫酸-重铬酸钾法测定。全氮和碱解氮的含量分别采用半微量凯氏定氮法和碱解扩散法。有效磷测定采用0.05mol·L–1HCl和0.025mol·L–1（1/2H2SO4）浸提—钼锑抗比色法。速效钾测定采用乙酸铵浸提—火焰光度法。经测定三个森林土壤pH为3.88~4.16，含水量173.1~203.4g·kg–1，有机碳14.01~16.62g·kg–1，全氮0.76~1.02g·kg–1，碱解氮123.24~142.81mg·kg–1，有效磷6.34~10.49mg·kg–1，速效钾56.12~60.15mg·kg–1。
土壤微生物总DNA提取采用FastDNASpinkitforsoil试剂盒（MPBiomedicals，美国）。根据试剂盒操作说明提取土壤微生物总DNA，并使用NanodropND-1000超微量分光光度计（NanoDropTechnologies，Wilmington，DE，美国）和1%的凝胶电泳检测DNA浓度和质量，将DNA于–20℃保藏。
分别采用两种方法计算宏基因组中AOA、AOB和comammox的amoA基因相对丰度。第一种方法，基于Mapped到amoA基因的HiSeqreads数统计。第二种方法，统计宏基因组中参与三种amoAcontigs拼接所用的HiSeqreads数，reads数高低反映了该类基因的相对丰度高低。即根据amoA基因参考序列，通过BLASTX与原始reads进行比对，统计其中Evalue≤10–5，同源性≥70%，blasthit区域大于25个氨基酸长度的reads数目，通过比较三种amoA基因mapping的reads总数，确定三者间的相对丰度。
本文利用qPCR、凝胶电泳半定量和宏基因组测序等技术研究酸性森林土壤氨氧化微生物的群落结构。qPCR显示AOA和AOB的amoA基因丰度为2.61×106copies·g–1和1.45×106copies·g–1。而comammoxamoA基因的扩增引物产生明显的非特异性扩增，导致qPCR结果的高估。半定量和宏基因组分析发现，氨氧化微生物amoA基因相对丰度为：comammox：AOA=0.55，comammox：AOB=0.98，推算comammoxamoA基因真实丰度为（1.38~1.47）×106copies·g–1。此外，AOA主要类群为group1.1b占其总丰度的88.07%，而经典嗜酸类群group1.1a-associated仅占11.93%。AOB主要类群为Nitrosospira（63.96%），而Nitrosomonas为36.04%。comammox主要类群为cladeB（63.39%），而cladeA仅占36.61%且均隶属于cladeA.1亚枝。
致谢感谢浙江农林大学孙凯和张云晴等同学在样品采集和理化性质测试中给予的帮助！