曾雪晴1，李洪军1,2，袁琳娜1，贺稚非1,2*
1(西南大学食品科学学院，重庆，400715)2(重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆，400715)
关键词郫县豆瓣酱；生物胺；高效液相色谱；食品安全；丹磺酰氯
从郫都区境内采购了21种不同郫县豆瓣酱(包括11种传统郫县豆瓣酱及10种红油郫县豆瓣酱)，采购后样品置于4℃冷藏，并尽快进行分析。
1.2.1仪器
PB-10酸度计，北京赛多利斯科学仪器有限公司；台式低温高速离心机，德国Eppendorf公司；LC-20AD高效液相色谱仪，日本岛津公司；ZWY-2102C型恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；XHF-D高速分散均质机型，宁波新芝生物科技股份有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅，金坛市富华仪器有限公司；BSA323S型电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；78HW-1型恒温磁力搅拌器，海思重试验设备有限公司。
1.2.2试剂
标准品：色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺及精胺(色谱纯度>99%)，购自重庆市钛新化工有限公司。
其他主要试剂：丙酮、乙腈、甲醇、丹磺酰氯(色谱级)；NH3·H2O、HClO4、NaOH、HCl、Na3CO3(分析纯)等，购自重庆市钛新化工有限公司；娃哈哈超纯水。
1.3.1生物胺标准溶液配制
准确称取8种生物胺标准品用0.1mol/LHCl配制成1000mg/L的单标储备液，各吸取8种单标储备液1.00mL于10mL容量瓶中，用0.1mol/LHCl定容，以配制成质量浓度为100mg/L的生物胺混合使用液。稀释生物胺混合使用液使系列标准溶液质量浓度分别为0.5、1、2.5、5、10、15、25及50mg/L。
1.3.2样品中生物胺提取
准确称取研磨均匀郫县豆瓣酱10.00g置于100mL离心管中，加入20mL0.4mol/LHClO4溶液，均质2min后，4000r/min离心20min，小心移取上清液至50mL棕色容量瓶中。沉淀用20mL0.4mol/LHClO4重复提取1次及离心，合并上清液并定容至刻度。量取上述提取液15mL于具塞试管中，加入10mL正己烷旋涡振荡2min，3600r/min离心5min后弃去上层有机相，再重复脱脂1次即可获得样品生物胺提取液。
1.3.3生物胺的衍生
根据BEN-GIGIREY的方法[6]稍作调整，移取样品提取液或生物胺系列标准溶液1mL，依次加入2mol/LNaOH溶液200μL、饱和NaHCO3溶液300μL及10mol/mL丹磺酰氯(溶于丙酮)2.5mL，旋涡振荡60s后于40℃水浴锅避光反应40min，期间每隔15min振荡1次。加入100μL25%(体积分数)NH4·H2O后，于25℃水浴锅避光静置30min以终止反应并除去多余的丹磺酰氯。反应结束后用乙腈定容至5mL，混合物在4℃下3000r/min离心10min，取适量上清液过0.22μm滤膜进液相小瓶待测，所有样品均一式3份。高效液相色谱进样体积20μL，色谱柱使用HypersilGOLD-C18，柱温35℃，流速1mL/min，检测波长为254nm。洗脱梯度程序如表1所示。
表1生物胺梯度洗脱程序Table1Thegradientelutionprogramforseparationofbiogenicamines
1.3.4其他理化指标
根据GB5009.42—2016对样品的盐含量进行检测；根据GB5009.235—2016对样品的氨基酸态氮及总酸进行测定。
根据JUNG[7]等描述的方法，取50mL去离子水加入10g样品中，充分均质后，在室温下用酸度计测定。
所有数据均使用SPSSStatistic19.0软件进行分析，结果采用Origin8.6软件进行绘图。
1-色胺；2-β-苯乙胺；3-腐胺；4-尸胺；5-组胺；6-酪胺；7-亚精胺；8-精胺图115μg/mL生物胺标准溶液与郫县豆瓣酱中生物胺检测色谱图Fig.115μg/mLbiogenicaminesstandardsolutiondetectionandbiogenicaminesinhorsebeanpastedetectionchromatogram
表3郫县豆瓣酱中生物胺的含量单位：mg/kg
Table3ThecontentofbiogenicaminesinPixianhorsebeanpaste
注：每个样品检测3次；ND：未检测到。
图2不同种类郫县豆瓣酱样品中生物胺的比较Fig.2ComparisonofbiogenicaminesindifferentcategroiesofPixianhorsebeanpastesamples注：同一列中不同字母表示不同差异，P<0.05。
生物胺色胺β-苯乙胺腐胺尸胺组胺酪胺亚精胺精胺色胺10.7020.1920.0320.2740.165-0.195-0.262β-苯乙胺10.421-0.0440.4440.2950.3270.259腐胺10.5760.8990.8850.2780.047尸胺10.5310.5920.230-0.235组胺10.9630.190-0.067酪胺10.172-0.124亚精胺10.745精胺1
图3样品中组胺和酪胺含量之间的线性关系Fig.3Linearrelationshipbetweenhistamineandtyraminecontentinsamples
a-pH与生物胺线性关系;b-总酸含量与生物胺线性关系;c-盐含量与生物胺线性关系;d-氨基酸态氮与生物胺线性关系图4郫县豆瓣酱品质指标与总生物胺含量之间的线性关系Fig.4Linearrelationshipbetweentotalbiogenicaminescontentandqualityindexesofpixianhorsebeanpaste
本文建立了柱前衍生高效液相色谱分析郫县豆瓣酱中生物胺的方法，结果表明，8种生物胺的线性关系好均大于0.998，其中样品日间精密度均小于5%，检测限范围为0.009～0.136mg/kg，平均加标回收率为76.33%～100.89%，说明本方法准确、灵敏、重现性较好，可用于发酵郫县豆瓣酱产品中生物胺的检测。
参考文献
[1]TASSONIA,MARIAANTONIETTAGERMANà,BAGNIN.FreeandconjugatedpolyaminecontentinCitrussinensisOsbeck,cultivarBrasilianoN.L.92,aNavelorange,atdifferentmaturationstages[J].FoodChemistry,2004,87(4):537-541.
[2]KERunwei,WEIZongsu,BOGDALC,etal.ProfilingwinesinChinaforthebiogenicamines:Anationwidesurveyandpharmacokineticfatemodelling[J].FoodChemistry,2018,250:268-275.
[3]WARTHESENJJ,SCANLANRA,BILLSDD,etal.FormationofheterocylicN-nitrosaminesfromthereactionofnitriteandselectedprimarydiaminesandaminoacids[J].CommunicationsinNonlinearScience&NumericalSimulation,1975,20(2):516-535.
[4]?NALA.Areview:Currentanalyticalmethodsforthedeterminationofbiogenicaminesinfoods[J].FoodChemistry,2007,103(4):1475-1486.
[5]LIXiyang,ZHAOChangsong,ZHENGChao,etal.CharacteristicsofmicrobialcommunityandaromacompoundsintraditionalfermentationofPixianbroadbeanpasteascomparedtoindustrialfermentation[J].InternationalJournalofFoodProperties,2017,20(sup3):S2520-S2531.
[6]BEN-GIGIREYB,VIEITESBAPTISTADESOUSAJM,VILLATG,etal.Changesinbiogenicaminesandmicrobiologicalanalysisinalbacore(Thunnusalalunga)muscleduringfrozenstorage[J].JournalofFoodProtection,1998,61(5):608-615.
[7]JUNGWY,JUNGJY,LEEHJ,etal.FunctionalcharacterizationofbacterialcommunitiesresponsibleforfermentationofDoenjang:atraditionalKoreanfermentedsoybeanpaste[J].FrontiersinMicrobiology,2016,7:827.
[8]BIJIKB,RAVISHANKARCN,VENKATESWARLUR,etal.Biogenicaminesinseafood:areview[J].JournalofFoodScienceandTechnology,2016,53(5):2210-2218.
[9]BYUNBY,BAIX,MAHJH.OccurrenceofbiogenicaminesinDoubanjiangandTofu[J].FoodScienceandBiotechnology,2013,22(1):55-62.
[10]SHALABYAR.Significanceofbiogenicaminestofoodsafetyandhumanhealth[J].FoodResearchInternational,1996,29(7):675-690.
[11]BTENBRINKB,DAMINKC,JOOSTENH,etal.Occurrenceandformationofbiologicallyactiveaminesinfoods[J].InternationalJournalofFoodMicrobiology,1990,11(1):73-84.
[12]PAPAGEORGIOUM,LAMBROPOULOUD,MORRISONC,etal.Literatureupdateofanalyticalmethodsforbiogenicaminesdeterminationinfoodandbeverages[J].TrACTrendsinAnalyticalChemistry,2018,98:128-142.
[13]YANGJuan,DINGXiaowen,QINYingrui,etal.Safetyassessmentofthebiogenicaminesinfermentedsoyabeansandfermentedbeancurd[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2014,62(31):7947-7954.
[14]LEFEVRES,ASTIERC,KANNYG.Histamineintoleranceorfalsefoodallergywithhistaminemechanism[J].RevueFrancaiseDAllergologie,2017,57(1),24-34.
[15]RUIZ-CAPILLASC,HERREROAM.Impactofbiogenicaminesonfoodqualityandsafety[J].Foods,2019,8(2):62.
[16]BARDCZS.Polyaminesinfoodandtheirconsequencesforfoodqualityandhumanhealth[J].TrendsinFoodScience&Technology,1995,6(10):341-346.
[17]PESSIONEE,MAZZOLIR,GIUFFRIDAMG,etal.Aproteomicapproachtostudyingbiogenicamineproducinglacticacidbacteria[J].Proteomics,2005,5(3):687-698.
[18]BYUNBY,MAHJH.OccurrenceofbiogenicaminesinMiso,Japanesetraditionalfermentedsoybeanpaste[J].JournalofFoodScience,2012,77(12):T216-T223.
[19]NOUTMJR,RUIKESMMW,BOUWMEESTERHM,etal.Effectofprocessingconditionsontheformationofbiogenicaminesandethylcarbamateinsoybeantempe[J].JournalofFoodSafety,1993,13(4):293-303.
[20]JEONAR,LEEJH,MAHJH.BiogenicamineformationandbacterialcontributioninCheonggukjang,aKoreantraditionalfermentedsoybeanfood[J].LWT,2018,92:282-289.
[21]HASSAINEO,ZADI-KARAMH,KARAMNE.EvaluationofbiogenicaminesformationbyproteolyticenterococcistrainsisolatedfromrawdromedarymilksfromsouthernAlgeria[J].JournalofFoodSafety,2009,29(3):381-393.
[22]PEREIRACI,MATOSD,SANROMAOMV,etal.DualRolefortheTyrosineDecarboxylationPathwayinEnterococcusfaeciumE17:ResponsetoanAcidChallengeandGenerationofaProtonMotiveForce[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2009,75(2):345-352.
[23]卢士玲,李开雄,徐幸莲,等.环境因素对屎肠球菌产苯乙胺和酪胺的影响[J].食品与发酵工业,2012,38(10):57-62.
[24]HERNNDEZ-HERREROMM,ROIG-SAGUéSAX,RODRíGUEZ-JEREZJJ,etal.Halotolerantandhalophilichistamine-formingbacteriaisolatedduringtheripeningofsaltedanchovies(Engraulisencrasicholus)[J].JournalofFoodProtection,1999,62(5):509-514.
[25]EMBORGJ,DALGAARDP.Modellingtheeffectoftemperature,carbondioxide,wateractivityandpHongrowthandhistamineformationbyMorganellapsychrotolerans[J].InternationalJournalofFoodMicrobiology,2008,128(2):226-233.
[26]LUYongmei,CHENXiaohong,JIANGMei,etal.BiogenicaminesinChinesesoysauce[J].FoodControl,2009,20(6):593-597.
[27]LORENZOC,BORDIGAM,PéREZ-LVAREZEP,etal.Theimpactsoftemperature,alcoholicdegreeandaminoacidscontentonbiogenicaminesandtheirprecursoraminoacidscontentinredwine[J].FoodResearchInternational,2017,99:328-335.
[28]MARCOBAL,MARTN-LVAREZPJ,MORENO-ARRIBASMV,etal.AmultifactorialdesignforstudyingfactorsinfluencinggrowthandtyramineproductionofthelacticacidbacteriaLactobacillusbrevisCECT4669andEnterococcusfaeciumBIFI-58[J].ResearchinMicrobiology,2006,157(5):417-424.
ZENGXueqing1,LIHongjun1,2,YUANLinna1,HEZhifei1,2*
1(CollegeofFoodScience,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China)2(ChongqingEngineeringResearchCenterofRegionalFood,Chongqing400715,China)
KeywordsPixianhorsebeanpaste;Biogenicamines;Highperformanceliquidchromatography;Foodsafety;Dansylchloride
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.021086
第一作者：硕士研究生(贺稚非教授为通讯作者，E-mail：2628576386@qq.com)。
基金项目：国家重点研发计划资助(2016YFD0401503)；重庆市特色食品工程技术研究中心能力提升项目(cstc2014pt-gc8001)